吸入制剂非临床评价的考量要点 于冰，陈一飞，付淑军，陈桂良，王庆利 （国家药品监督管理局药品审评中心， 北京100022；上海药品审评核查中心，上海201203） （以下图片点开可查看高清大图）

本文选自：中国临床药理学杂志 第39卷 第11期 作者简介：尹茂山，主管药师，主要从事新药药理毒理的审评工作 通信作者：于冰，副主任药师 作者单位：国家药品监督管理局 药品审评中心 摘要 药物制剂经非口服途径给药，对给药局部产生的毒性、刺激性和/或对全身产生过敏性和溶血性等均属于制剂安全性的范畴，是药物非临床安全性评价的重要组成部分。药物制剂安全性评价中经常出现不规范或不符合指导原则等科学规范问题，无法为临床试验和用药提供足够的非临床安全性信息。本文结合审评工作中发现的相关问题进行讨论，以期为申请人及安评机构在开展药物制剂安全性评价时提供借鉴。 药物制剂安全性试验又称特殊安全性试验或局部安全性试验，包括刺激性、过敏性及溶血性等试验，评价药物在经非口服给药途径下对用药局部产生的毒性和/或对全身产生的毒性，如眼、耳、鼻、舌下、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、血管、肌肉、皮下和髓鞘等。药物毒性来源主要包括药物活性成分及其代谢物、辅料、杂质及pH值、渗透压等制剂理化性质，这些因素可引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官和安全范围。 目前，药物制剂安全性的研究指南主要为《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》（2014年），根据国外药物研究评价的经验积累，参考了国外相关技术指南，如美国国家食品药品监督管理局针对仿制透皮制剂产品皮肤刺激性及致敏性研究指南、光安全测试指南、新药免疫毒理学评价指南、欧洲药品管理局药品非临床局部测试指南，此外还参考了国际标准化组织关于医疗器械生物学评价中关于刺激性和迟发过敏性反应试验的相关研究策略。同时，需要指出的是，该指导原则收载了试验方法的一般原则，具体评价中应根据受试物的特点进行合理设计。制剂安全性试验的评价工作或审评过程，既有强制性要求，如药物非临床研究质量管理规范（GLP）的遵从性，也需要对一般试验设计基本原则的遵循，如试验设计与实施应当遵从试验研究的“随机、对照、可重复”原则，根据受试物的特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学及临床拟定用法用量等进行综合评价，体现整体性、综合性的原则。本文结合审评工作中发现的相关问题进行讨论，以期为申请人及安评机构在开展药物制剂安全性评价时提供借鉴。 1 制剂安全性研究开展的必要性 非口服给药途径的药物一般均需获得足够的非临床制剂安全性信息。目前，仍有申请人忽视产品制剂安全性研究的重要性，审评中遇到未按照相关要求开展制剂安全性研究，或者未按指导原则的要求完成规范的制剂安全性研究，无法为后续的临床试验或上市提供充分的制剂安全性风险提示，导致临床试验申请或上市申请进度受影响。常忽视开展制剂安全性试验的药物剂型包括阴道栓剂、直肠栓剂、舌下透皮吸收制剂、皮肤外用制剂等。应当根据拟开发药物制剂的自身特点考虑开展相关研究的必要性。 【案例1】 盐酸多塞平口颊膜按化药注册分类“2.2”申报，系在美国批准的低剂量盐酸多塞平片基础上的改良型药物，将片剂改为口颊膜，申请适应证相同，为用于治疗睡眠维持困难的失眠症。申请人未开展制剂安全性研究，而口颊膜作为一种经口腔给药和吸收的制剂，具有潜在的口腔黏膜刺激性风险，应进行口腔黏膜刺激性试验，为临床试验提示相关风险。 【案例2】 他达拉非口溶膜按化药注册分类“2.2”申报，口溶膜制剂学特性类似于口腔崩解片，不同于口含片、舌下含片，口腔局部存留时间较短，口腔黏膜几乎不吸收，类似于口服制剂经胃肠道吸收，故审评考虑可不要求提供该制剂口腔黏膜给药的制剂安全性研究数据。 2 GLP遵从性 《中华人民共和国药品管理法》（2019年版）规定“药物的非临床安全性评价研究机构必须执行药物非临床研究质量管理规范”。最新修订的《药品注册管理办法》（2020年版）也明确规定：药物非临床安全性评价研究应当在经过药物非临床研究质量管理规范认证的机构开展，并遵守GLP。药物非临床制剂安全性作为非临床安全性的一部分，应当执行GLP规范。目前，仍有少数制剂安全性试验在非GLP条件下开展，不符合相关法律法规要求，也不利于试验质量的保障。 3 制剂安全性评价关注点 3.1 供试品分析 供试品分析揭示受试品的质量和配制的准确性，为临床前安全评价中发现的问题（如毒性与剂量关系等）提供可靠的科学参考。如果供试品存在问题，安评的结果可能失去了技术评价的价值，甚至可能误导新药的后期开发。因此，供试品检测对于新药安全性评价具有重要意义，应该在安全性评价试验中进行科学的供试品检测。例如，注射剂浓溶液或注射用粉针剂在使用前，应当根据临床拟用的真实情况进行配制，配制后需要开展供试品分析，以便在非临床试验中正确使用。若临床拟用样品为制剂原液，往往企业会向安评机构提供其质量检验合格报告，表明相关供试品的检测信息，不需要在安评机构重新开展供试品分析。一般来说，应根据供试品的特性及具体毒理试验的要求在试验方案中确定误差范围，化学药物配制后的溶液及混悬浓度与理论可接受误差范围为：溶液为±10%，混悬液为±15%。生物技术药物供试品分析的方法选择和技术要求一般应遵从Case by case的原则开展，如根据生物活性分析等方法进行含量检测。 除了供试品分析之外，用于非临床安全性评价试验的供试品质量信息提供方面也存在一些影响安全性评估的问题，如供试品的重要信息缺失，供试品浓度和含量分析的方法学验证资料和配制后供试品质量检测结果等。另外，试验样品制备工艺不成熟，可能导致不同批次的样品质量（含量、纯度、杂质、晶型等）不一致，进而影响安全性评价试验数据的准确、可靠。更有甚者，试验单位未开展或未提供供试品分析报告，或者供试品分析报告显示“不合格”，仍采用该试剂开展制剂安全性研究。 【案例3】 某氨茶碱注射液申报仿制药一致性评价，用色谱法对配制的供试品及原研制剂低浓度制剂（质量浓度6.25 mg·mL-1）进行分析，无水茶碱测定浓度为理论浓度的77.87%~81.36%，供试品配制可能存在较大误差，不符合供试品分析的相关要求（±10%）。 3.2 实验动物种属选择 动物种属的选择应当根据解剖学、生理学、代谢反应、遗传学和免疫反应来选择特定研究需要的最合适的模型，同时应当考虑观察指标和模型合理性确定，如皮肤刺激性试验应选择与人类皮肤结构比较相近的动物，如兔、小型猪等。在涉及皮肤给药途径的药物制剂安全性研究中，小型猪可能比任何其他动物模型更接近地模拟人类反应，主要原因是其与人类在皮肤解剖学、生理学和生物化学方面具有相似性，具有大量人类共有的膜转运和酶蛋白质，使得小型猪是理想的皮肤外用途径生物医学研究与开发中的转化模型。 3.3 制剂安全性研究的常见问题 制剂安全性研究的内容一般包括刺激性、过敏性及溶血性试验，应当根据药物临床拟用情况合理设计试验中的给药剂量、给药浓度及给药体积等关键性指标。例如，临床使用中涉及不同药物浓度的情况时，应当采用临床拟用最高浓度开展刺激性研究；多品规同时申报，应当考虑不同规格之间浓度一致性、是否仅为装量的差异、辅料是否等比例等因素，针对多浓度规格品种应当至少采用临床使用最大浓度开展制剂安全性评价；对于一致性评价品种，还应当选择相同品规的参比制剂平行开展对照研究，且参比制剂应当被国家局公布的《参比制剂目录》收录。现以案例的形式，对申报资料中常见的具体试验问题进行梳理。 3.3.1 试验动物数量不足 在试验设计时，动物数量的确定需要考虑实验动物伦理“3R”原则（replacement，reduction，refinement），同时也需要满足统计学要求。 【案例4】 某葡萄糖酸钙注射液的仿制品种，用兔开展静脉注射刺激性试验，试验选用健康日本大耳白兔4只（2雌2雄），用同体左右侧自身对照法，每只动物右侧耳缘静脉给予供试品，左侧耳缘静脉给予同体积5%葡萄糖注射液，连续给药，试验设置给药期末及恢复期末剖检时间点（各1雌1雄）。本试验设置动物数量偏少，无法满足统计学要求，在后续的观察中可能存在对阳性结果分析的难度。此类试验，一般应当考虑到给药期末及恢复期末的2个解剖观察时间点，应保证每个剖检时间点的动物数据至少支持统计学计算。 3.3.2 刺激性试验问题 刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，一般应选择与临床给药相似的给药部位，并观察对可能接触到受试物的周围组织的影响，例如考察血管刺激性试验应当对进针点血管的近段、中段及远段的刺激性，同时可附带肌肉刺激性考察；给药浓度、剂量与体积的设置应至少包括临床拟用最高浓度，临床静脉滴注给药刺激性试验可采用泵给药；给药频率与周期应根据临床用药情况，一般刺激性试验的给药周期最长不超过4周，其中血管刺激性试验最长不超过7 d；当出现阳性结果时，应当对造成阳性结果的可能原因进行分析。 制剂刺激性研究中常见的问题包括：未按照临床拟用给药方式、给药频率设计试验；临床用法中存在多种给药方式，未针对所有可能的给药方式开展研究。制剂安全性评价中，部分临床拟用给药方式在动物中无法模拟或操作困难，如脊髓鞘内、口腔黏膜、脑内给药等，可以考虑替代性研究方式。对于给药期末及恢复期的刺激性评估，需进行组织病理学检查，检查结果尽可能转化为可量化指标，如病变分级等，通常采用病变程度和发生率进行评估。比较特殊的眼用制剂刺激性研究应遵照相关指导原则的要求开展裂隙灯检查。 【案例5】 某一致性评价品种硫酸阿米卡星注射液，仅用参比制剂国外说明书临床用法用量情况[在静脉滴注的情况下，通常以100~200 mg（效价）的速度溶解在补液100~500 mL中，并在30~60 min内给药]拟定刺激性试验给药浓度为2 mg·mL-1，而参比制剂国内现行说明书（肌内注射或静脉滴注给药：当静脉内给予时可以按每500 mg加入无菌稀释剂100或200 mL来配制，如0.9%NaCl或5%的葡萄糖注射液或其他合适的溶液）中临床拟用最高浓度为5 mg·mL-1，不符合指导原则的要求。 吸入方式给药的制剂，包括粉雾剂、喷雾剂等剂型，应根据制剂自身的特点，尽可能模拟临床给药方式。试验中应采用符合试验动物自身特点的吸入装置或雾化装置，并进行充分的试验条件系统性验证（如气溶胶质量浓度、气溶胶粒径分布等），以获取稳定的气溶胶或粉雾气流，一般通过改变通气时间的方法完成不同剂量组给药，组织病理学检查应根据制剂药效及药代动力学特征，选取呼吸道不同部位组织器官进行病理学检查。 【案例6】 某噻托溴铵吸入粉雾剂，采用了经口喷雾给药的方式开展了制剂安全性试验，用兔经口腔喷雾给药方式，每天1次，连续给药28 d，未见对呼吸道给药局部组织的刺激作用，审评认为申请人所提供的局部安全性试验都不是吸入给药，试验结果不能体现临床拟给药方式的制剂安全性特征，需补充吸入给药途径的制剂安全性试验资料。 【案例7】 某富马酸福莫特罗吸入气雾剂（混悬型），与已上市富马酸福莫特罗吸入制剂（溶液型）相比，规格相当，给药途径相同且作用机制一致，按化药注册分类“2.2”申请临床试验，制剂安全性试验用大鼠全身暴露给药装置，经雾化吸入给药。申请人在分析该品种刺激性试验中，结合供试品在呼吸道局部及肺组织的暴露情况，并采用机构历史研究数据分析雾化吸入给药与直接揿压阀门吸入2种给药途径在呼吸道局部及肺组织的暴露差异较小，基本支持该品种桥接已上市制剂的药理毒理数据。 3.3.3 过敏性试验问题 过敏性又称超敏反应，系机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应。通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察Ⅰ型过敏反应，如注射剂需进行主动全身过敏试验（ASA）和被动皮肤过敏试验（PCA），透皮吸收剂需进行主动皮肤过敏试验（ACA），吸入途径药物用豚鼠吸入诱导和刺激试验，黏膜给药应结合受试物的特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。因此，选择开展何种过敏性试验应根据药物特点、临床适应证、给药方式、过敏反应发生机制、影响因素等确定。 结合最常开展的主动全身过敏反应，试验结果与给予的致敏剂剂量，特别是激发剂量有较大关系，也与致敏的时间有一定关系，而与制剂的致敏浓度相关性略低。 值得关注的是，过敏性试验研究中常出现由于供试品毒性或特殊药理作用较强而导致动物死亡或其他严重异常表现，容易与过敏反应混淆发生，无法清晰地识别过敏反应风险。针对此类特殊情况，制剂过敏性试验的评价应当采用更为灵活的试验设计。 【案例8】 某注射用头孢替安仿制品，由于豚鼠对头孢类药物较为敏感，易产生消化道出血、坏死等毒性，在致敏期间动物即因消化道毒性全部死亡，可考虑结合大鼠被动皮肤过敏试验进一步评估过敏性。此外，针对常见的细胞毒类抗肿瘤药物，也存在过敏试验中动物死亡的问题，此类动物死亡一般也可归因于动物对制剂毒性的不耐受，可能与过敏反应相关性不大，但该类试验应采用设置参比制剂平行对照试验的方法开展研究，同时申报资料中应当包括预试验研究信息，以支持剂量选择的合理性。 另外，虽然动物试验中的吸入给药装置难以完全模拟人体吸入给药的暴露情况，但吸入制剂作为变应原可能会激发机体呼吸道黏膜免疫，进而由免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型超敏反应发生，易引起安全性风险，因此吸入制剂采用吸入给药途径进行过敏性评估仍然具有必要性。 3.3.4 溶血性试验问题 溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应，凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他局部用药制剂均应进行溶血性试验。溶血试验包括体外试验和体内试验，常规采用体外试管法评价药物的溶血性，采用人血或兔血红细胞悬液试验体系，供试品应达到临床拟用最高浓度，仿制药一般应采用参比制剂对照开展研究，对于试验阳性结果，应当结合动物体内毒理学研究观察溶血反应的有关指标（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白，肾、脾、肝继发性改变等），如出现体内溶血时，应对制剂的溶血风险开展进一步研究，与相同给药途径的上市制剂进行比较研究，必要时进行动物体内试验或结合重复给药毒性试验，应对相关机制进行探究，并推断与人体的相关性，以提示临床风险。 3.3.5 制剂安全性研究结果分析与评价 制剂安全性研究结果分析中，应详细说明不同组别用药情况、毒性反应、持续时间、恢复情况及时间、死亡动物数等关键信息，对不同剂量（或浓度）下某种反应发生情况及严重程度进行表述，分析毒性反应的量效关系和可能的时效关系及可逆性，判断药物相关性，提供安全范围等。刺激性试验应重视给药浓度、速度及次数等因素与结果的相关性分析，关注组织病理学检查并提供相应的图片结果；过敏性试验应注意给药剂量和给药速度对过敏反应的影响；溶血性试验中，若出现红细胞凝聚现象，应判定是真凝聚还是假凝聚，若体外出现可疑溶血现象，应采用其他方法进一步评估，以确定或排除受试物的溶血作用。此外，制剂安全性试验结果往往存在多种不确定性，由于试验设计的问题（缺少参比对照）、试验动物质量（阴性对照组异常结果）等问题，导致对试验结果无法做出准确的判断。 【案例9】 某吸入用盐酸氨溴索溶液按化学药品注册分类“3”申报验证性临床试验，用兔开展了制剂安全性试验，结果显示：兔多次雾化吸入局部刺激性试验中，阴性对照组动物可见鼻甲、咽喉、气管和肺及支气管黏膜出现黏膜上皮变性、坏死、增生，以及黏膜炎细胞浸润等炎症反应，出现的病理改变程度和比例明显高于同类试验，提示现有的试验体系可能无法判断动物产生呼吸道症状是否与供试品刺激性相关，审评认为该试验体系尚不能满足对吸入给药局部刺激性的评价。审评建议申请人结合已有非临床试验结果、安评机构背景数据、试验质量控制等因素，分析吸入给药局部刺激性试验结果中阴性对照组出现的病理改变程度和比例明显偏高的原因，选择合适的试验体系重新开展该品种吸入给药途径的刺激性试验。 【案例10】 某酒石酸阿福特罗雾化吸入用溶液按化药注册分类“3”申请验证性临床试验，该品种设计开展的刺激性试验仅设置阴性对照组和供试品组，供试品吸入途径给药可见轻度呼吸道黏膜刺激性，表现为肺血管周围轻微混合炎性细胞浸润、肺泡轻微巨噬细胞聚集，鼻轻度急性炎症，鉴于该品种吸入给药出现呼吸道刺激性情况，而未设置恢复观察期，也未设置参比制剂对照组，故无法判断本品刺激性反应的可逆性，也无法判断刺激性反应严重程度是否高于参比对照，应当重新开展规范设计的、与参比制剂对照进行的刺激性试验。 【案例11】 某德谷胰岛素利拉鲁肽注射液按生物类似物申报，溶媒对照组、自研品及原研对照组均可见高发生率的动物临床观察异常表现（发抖、排粪、排尿现象），发生率分别为100.0%或91.7%，申请人判断为“类过敏反应”，而非过敏反应。为佐证判断，试验人员在激发给药阶段，同时选择健康未致敏动物（每组4只）进行激发试验，显示出相似的异常表现为“发抖、排粪、排尿等现象”，符合相关指导原则关于“类致敏反应”的判断。 4 其他需要开展制剂安全性情形 除了上述讨论的仿制药申请（包括一致性评价产品）需要关注制剂安全性评价外，创新药（包括改良新药）、生物制品变更等也需要特别关注制剂安全性的评估。 4.1 创新药 创新药的临床试验申请，一般需要提交全面的安全性评估资料。在制剂安全性研究方面，可以单独开展，也可以结合重复给药毒性试验数据开展，但伴随毒理学开展的制剂安全性评价应当涵盖制剂临床最高拟用浓度，如无法达到制剂相关浓度要求，应当开展单独的制剂安全性评估。 【案例12】 某降糖药按化药注册分类“1”申请临床试验，同时在临床试验期间新增制剂规格，原获批临床规格为1.5 mL/3 mg（质量浓度2 mg·mL-1），现申请新增规格为3 mL/30 mg（质量浓度10 mg·mL-1），仅新增一项单次给药的刺激性试验，而已完成的多项重复给药毒性试验所用药物浓度均远低于本次新增规格的浓度，无法评估新规格制剂多次给药后的刺激性特征，临床试验期间存在未知的安全性风险。 【案例13】 某人源化免疫球蛋白G（IgG）1亚型双特异性抗体，系一种注射用粉针剂型，在食蟹猴重复给药毒性试验中，伴随观察该双抗静脉给药的局部刺激性，结果显示，在不同剂量组，供试品溶液最高给药质量浓度仅为3 mg·mL-1，未见输注给药相关的刺激性反应。同时，由于本品临床用法用量未确定，而临床试验给药方案显示，临床试验期间最大给药质量浓度可能达到5.4 mg·mL-1，可能存在现有制剂安全性试验未提示的局部刺激性风险，应在临床试验前采用临床最大拟用浓度重新进行局部刺激性试验，并根据试验结果完善临床试验风险控制计划，确保受试者安全。 4.2 改剂型产品 除了前述提及的2款口颊膜、口溶膜制剂等改良型新药存在的问题，还有其他改剂型相关产品存在制剂安全性评价不足的问题。 【案例14】 某丁苯酞注射液按化药注册分类“2.2”申报临床试验，系由已上市的丁苯酞氯化钠注射剂（大输液，规格100 mL/25 mg）改成小容量注射剂（规格5 mL/25 mg），申请人未针对小容量制剂开展制剂安全性研究，仅提供了原报大输液制剂的研究资料作为参考，审评认为虽然大输液制剂与前期开发的丁苯酞氯化钠注射液的活性成分、适应证、给药途径、给药方法、单次给药剂量、主药辅料厂家以及生产工艺方面一致，但仍无法充分评估本次申报产品的制剂安全性特征，需要针对新报制剂开展制剂安全性研究。 4.3 生物制品变更 生物制品的制剂安全性评价思路与化学药品相似。而生物制品制剂的变更，尤其是涉及中等以上变更，往往是风险更高的一类情况，例如生产场地变更、生产规模变更、关键工艺控制及质量控制参数变更等，往往均需要制剂安全性评估。此外，由于生物制品制剂常含白蛋白成分，系常见的过敏原，可能会出现过敏性试验的阳性结果，应当结合制剂特点，综合分析并提示临床风险。 针对临床试验期间的变更，一般遵从国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5E指导原则的要求，结合生物制品在变更前后药学的可比性进行综合评价，“如果生产商能通过本文件推荐的分析研究方法来保证可比性，产品可比性的确定可以仅以质量研究为基础。当质量数据对确定可比性不充分时，恰当地是从非临床或临床研究中获得补充证据”。但基于中国的药品监管实践，生物制品的药学变更（尤其是重大变更）所带来的安全性风险远高于化学药品的安全性风险，药学比对研究往往无法作出“变更前后一致性”的结论，故需要非临床安全性对比研究进行的风险提示。 针对上市后生物制品制剂开展的变更，应当在药学方面可比的基础上，对于《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）》中，分类定为重大变更的，均需提供制剂安全性数据，中等或微小变更，应基于生物制品可比性研究结果综合分析处理。特别需要指出的是，如果变更后产品已在境外获得批准并用于人体，建议结合临床安全性信息评估，可不再要求开展非临床制剂安全性研究。 5 讨论 药物的非临床安全性评价是基于风险的识别研究，而制剂安全性研究是非临床安全性研究的重要组成部分。我国药品监管部门一直关注药物制剂安全性评价，其中非临床制剂安全性评价是重要一部分。美国食品药品监督管理局也于2023年4月发布了一份修订指南草案，关注了仿制药透皮和局部给药系统制剂刺激性和致敏性潜力的评估，以期为仿制药申请人临床制剂安全性评价提供科学和清晰的研究思路。 药物的制剂安全性研究，应当遵循药物安全性评价的一般规律，结合药物的制剂特点、药理作用其他毒理学试验结果，以及临床信息等综合分析和评价，以期全面真实地反映临床用药实际，为临床用药安全提供风险控制信息，确保临床用药安全。

单晓蕾，黄芳华 * ，姜凯迪 ( 国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022 ) 摘要：近年来儿童用药成为药物开发热点，儿童人群临床试验逐渐增多。当支持开展儿童临床试验安全性的非临床和临床数据缺乏时，需要考虑开展幼龄动物试验，旨在阐述在其他非临床试验或儿童临床试验中无法得到充分阐述的安全性问题，包括潜在的长期安全性的影响。该文基于 2020 年发布的 ICH S11 支持儿童用药开发的非临床安全性指导原则并结合实际案例，阐述了幼龄动物试验的设计和实施的考虑要点，以期为我国儿童用药开发提供参考。 关键词：ICH S11；幼龄动物试验；儿童用药开发 近年来，我国持续鼓励、促进儿童用药的研发创新，儿童用药的申报、审评数量呈现逐年上升的趋势。拟开发用于儿童人群的药品，包括已经在成年人中使用的产品以及考虑首次用于儿童人群的产品，应根据具体情况考虑开展幼龄动物毒理学试验( 简称幼龄动物试验，juvenile animal study，JAS)。JAS 的设计、实施具有复杂性和较大难度，本文将结合案例，对 JAS 的一些考虑要点进行阐述和分析，为儿童用药的研发提供参考。 1、儿科药物开发的非临床安全性评价指导原则 由于儿童处于生长发育阶段，器官系统不成熟或在药物治疗期间系统成熟，对药物的药动学、药效学和脱靶效应可能产生影响，进而引起儿童人群在药物安全性和有效性方面与成人存在差异。因此，需要考虑是否需要进行 JAS，用以阐述其他非临床试验或儿童临床试验中无法得到充分阐述的安全性问题[1] 。 从 21 世纪开始，各国陆续发布了支持儿童用药开发的非临床安全性研究指导原则。FDA 于2006年发布了《儿科用药的非临床安全性评价指导原则》(Guidance for Industry: Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products) [2] ；EMA 于2008年发布了《儿科适应证用药的幼龄动物非临床试验必要性指导原则》(Guideline on the Need for Nonclinical Testing in Juvenile Animals on Human Pharmaceuticals for Pediatric Indications) [3] ，日本厚生劳动省 (Ministry of Health Labour and Welfare,MHLW) 于 2012 年发布了《儿科用药幼龄动物非临床安全性研究指导原则》(Guideline on Nonclinical Safety Studies in Juvenile Animals for Pediatric Drug Development) [4] 。为了促进区域间的协调一致，国际人用药品注册技术要求理事会 (ICH) 于 2014 年开始组建了 S11 专家工作组，对支持儿童用药开发的非临床安全性研究内容进行国际协调，于 2020年 4 月 14 日发布了 ICH S11《支持儿科药物开发的非临床安全性评价指导原则》(以下简称 S11)[1] ，我国国家药品监督管理局 (National Medical Products Administration，NMPA) 作为 ICH 成员参与了 ICH S11 的议题协调工作，并于 2021 年 1 月 21 日发布S11 实施公告 (2021年第15号)。 S11 推荐了支持儿童用药开发的非临床安全性评价的国际协调一致的标准，适用于拟开发用于儿童人群的小分子药物和生物制品，提出了 JAS 的必要性及 JAS 设计的具体要求。由于 JAS 的必要性和其试验设计需要具体问题具体分析，具有相当的灵活性，因此，本文结合案例分析，对幼龄动物试验的一些考虑要点进行探讨分析，以期为我国儿童用药开发提供参考。 2、附加 JAS 的考虑 ICH M3 和 S11 提出[1,5]：只有当已有的非临床和临床研究数据被认为不足以支持儿科研究时，才应进行附加的非临床试验。该附加的非临床试验一般是指 JAS。S11 对于是否需要进行附加的非临床安全性研究，提出了证据权重 (weigh of evidence，WoE) 法，WoE 评价需考虑的关键因素包括但不限于拟用患者的最小年龄、对发育中器官的不良影响、已有资料的数量和类型 ( 包括临床资料和非临床等资料 )、药物靶点对器官发育的作用、药物的选择性和特异性，以及临床给药期限等。其中，拟用患者的最小年龄以及对发育中器官系统的不良影响最为重要 ( 即最高权重 )。WoE 法需同时评估多种因素，应考虑每个因素的重要性，以最终确定现有数据是否能充分阐述在所申请儿童人群中的安全性担忧，或者附加的 JAS 能否阐述这些担忧[1] 。 拉考沙胺 (Lacosamide，商品名 Vimpat) 是美国 USB 公司开发的一种抗癫痫药物，于2008年10月首次被FDA批准上市，用于17岁以上患者人群[6] ，并要求上市后开展1月龄至17岁儿童的临床试验[7] 。基于拉考沙胺上市后开展的多项儿童临床试验数据，目前 FDA 批准拉考沙胺用于 1 月龄以上患者癫痫部分性发作的治疗以及 4 岁及以上患者原发性全身性强直阵挛发作的辅助治疗[8] 。 拉考沙胺作用于中枢神经系统 (central nervoussystem，CNS)，临床拟用患者年龄最低为 1 月龄，现有资料尚不足以说明对儿童用药的安全性，且靶点和毒理学试验均提示存在对发育中的 CNS 有潜在影响的担忧。因此，拉考沙胺完成的非临床安全性研究除一般的毒理学数据包 ( 包括大鼠、犬单次和重复给药毒性试验，遗传毒性、生殖毒性、致癌性试验 ) 外，为支持儿童人群的临床试验，进行了幼龄大鼠重复给药毒性试验，另外申请上市前还进行了幼龄犬重复给药毒性剂量范围探索试验 (GLP试验)[9] 。此外，该品种还进行了幼龄犬 33 周重复给药毒性试验。 拉考沙胺大鼠 JAS 中，幼龄大鼠从出生后日龄(postnatal day，PND)7 开始经口给予拉考沙胺 (每天 30、90、180 mg/kg)，连续给药 42 d，可见哺乳期间体重降低、雌性性成熟延迟、脑绝对和相对重量降低以及长期的神经行为改变 ( 旷场行为改变、学习和记忆缺陷 )[6,9] ，且大鼠发育神经毒性的无影响剂量下的暴露量低于人最大推荐剂量每天 400 mg时的暴露量。另外，体外试验结果显示，拉考沙胺会干扰涉及神经元分化和控制轴突向外生长的脑衰反应调节蛋白 -2(CRMP-2) 的活性[8] 。因此，不能排除拉考沙胺对 CNS 发育的潜在相关不良反应。 综上，拉考沙胺作为一种 CNS 药物，临床拟用患者最小年龄为1月龄，根据已有研究结果，不能排除药物对发育中的 CNS 潜在担忧，在儿童临床试验之前开展了大鼠 JAS，并可见拉考沙胺对大鼠 CNS 发育具有不良影响。值得注意的是，一般认为，在脑发育方面，大鼠出生后早期对应于人类妊娠晚期，因此，FDA 将上述风险提示信息写入说明书“特殊人群用药”项的“妊娠”和“儿科用药”中，为临床使用提供安全性信息[8] 。 3、试验设计要点 3.1 动物种属选择 在已有支持成人临床试验的毒理学数据包基础上，当需要进行 JAS 时，大多数情况下单一动物种属试验是足够的，原则上，在成年动物重复给药毒性试验中所使用的相同种属应是 JAS 首先考虑的种属，首选啮齿类动物。在所有情况下，应证明所选择的种属是合理的，为相关动物种属。只有在先用于儿科或对出生后发育有多种特殊担忧而单一种属无法阐述这些担忧的情况下，才需要进行 2 种种属的 JAS [1] 。 大鼠是成年动物重复给药毒性试验的常用种属，具有丰富的历史对照资料，且其发育时间短使得试验中可纳入大量的终点指标，观察出生后多个器官系统的发育，因此大鼠 ( 在其为相关动物种属时 ) 是 JAS 较常使用的动物。对于生物制品，大多数情况下非人灵长类 (non-human primate，NHP)为药理学相关种属，但由于科学和实际操作的原因，对离乳前 NHP 进行 JAS 具有很大的挑战性( 例如繁殖、运输和母体 / 婴仔对的处理 )，而离乳后 NHP( 大约 6 月龄 ) 器官系统的成熟度通常已超过了许多儿科相关年龄，在离乳后 NHP 中进行JAS 所增加的价值有限，只有在少数情况下，在离乳前 NHP 中进行 JAS 具有合理的价值，例如在拟用于新生儿和强化的围产期发育 (enhanced pre- and postnated developmental，ePPND) 试验中的暴露不充分的情况，因此，S11 鼓励采用替代方法 ( 如体外试验、转基因动物、替代分子 ) [1] 。 先用于儿科或儿科专用药物通常的临床策略通常是在儿科试验之前，先在健康成年志愿者进行首次人体 (FIH) 试验。但是，有一些案例，在没有成年患者或是健康志愿者数据的情况下对患儿给药( 例如，仅存在于儿童中的危急生命或衰弱的疾病，或者当药物无法安全地给予成年志愿者时 )，FIH 试验将在患儿中进行，此时非临床计划通常将包括一种啮齿类动物和一种非啮齿动物的 JAS，以及与成人用药所需相同的安全药理学和遗传毒性试验[1] 。 以下描述一个儿科专用药物采用 2 种幼龄动物种属进行毒理学的案例。 诺西那生钠 (nusinersen，商品名 Spinraza) 为美国 Biogen Idec 公司开发的一种反义寡核苷酸(ASO) 药物，可增加运动神经原存活基因 2 （survival motorneuron 2，SMN2）的 mRNA 转录本中外显子7的纳入以及全长 SMN 蛋白产生，经腰椎穿刺鞘内给药，用于治疗因染色体 5q 突变导致 SMN 蛋白缺乏而引起的脊髓性肌萎缩症 (spinal muscular atrophy，SMA)，一种造成婴幼儿死亡的严重的常染色体隐性遗传疾病。诺西那生钠于2016年12月经美国 FDA 批准上市，适用人群包括新生儿至17岁少年[10] 。 诺西那生钠在上市前完成的非临床安全性研究包括 ：大鼠鞘内给药安全药理学试验、遗传毒性试验 [ 细菌回复突变试验、体外中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese hamster ovary cell，CHO 细胞 ) 染色体畸变试验、小鼠体内骨髓微核试验 ]、生殖毒性试验 ( 小鼠生育力与胚胎发育试验、兔胚胎 - 胎仔发育毒性试验 )，以及幼龄猴和小鼠的毒性试验[11] 。FDA 要求上市后完成小鼠皮下给药 2 年致癌性试验以及啮齿类动物的围产期毒性试验[12] 。 重复给药毒性试验方面，诺西那生钠进行了2种动物的 JAS，包括幼龄食蟹猴 14 周和 53 周重复给药毒性试验、幼龄小鼠 13 周重复给药毒性试验共 3 个试验，其中食蟹猴在 ASO 的组织分布、细胞摄取、代谢和毒性敏感性方面更具代表性，故食蟹猴试验为核心试验。幼龄食蟹猴鞘内注射给予诺西那生钠每次 0.3、1、3 mg 连续 14 周 ( 猴给药起始年龄为 9 ～ 10 周龄，负荷剂量阶段每周给药 1 次，共 5 次，之后维持阶段每 2 周 1 次或每周给药 1 次 )或每次 0.3、1、4 mg 连续53 周 ( 猴给药起始年龄为 9 ～ 11 月龄，负荷剂量阶段每周给药 1 次，共 5 次，之后维持阶段为每 6 周给药 1 次 )。2 个试验中，高、中剂量组可见脑组织病理学改变 ( 海马神经元空泡化和坏死以及细胞碎片 )，高剂量组可见急性、短暂的低位脊髓反射缺陷。此外，猴 53 周试验中，高剂量组学习和记忆检测可见可能的神经行为学缺陷。按年计算并校正了不同种属间脑脊液体积差异后，猴神经组织病理学无影响剂量 (每次0.3 mg) 大约相当于人用剂量[10—11] 。另外进行了幼龄 CD-1 小鼠 13 周重复给药毒性试验，于出生后4 ～ 95 d 给药，在最高每次 50 mg/kg 的剂量下耐受性较好，可见寡核苷酸相关的变化[11] 。 综上，作为全球首个批准用于 SMA 治疗的 ASO 药物，诺西那生钠为儿科专用药物，拟用患者最小年龄为新生儿，直接对儿童开展临床试验，非临床安全性研究进行了幼龄小鼠3个月毒理学试验、幼龄食蟹猴鞘内给药 ( 临床拟用途径 )4 周和 53 周毒理学试验，并附加进行了 CNS 评估，可见对神经系统的不良影响，该风险提示信息纳入说明书。 3.2 动物开始给药年龄 动物开始给药年龄是 JAS 设计的关键性要素，应选择在发育上对应拟用患者的最小年龄，并考虑人与动物的毒理学担忧器官系统发育期的比较。由于不同种属之间不同器官的器官系统相关性并不一致，应优先考虑任何潜在担忧的靶器官 / 系统，或者是拟用患者人群中特别脆弱的正在发育中的系统[1] 。S11 在附录中详细列出不同动物种属器官系统的比较发育的概况，可以帮助选择合适的动物种属和年龄，以充分阐述所申请的儿童人群的安全性担忧。 在 2011 年发表的一项针对来自美国、欧洲和日本的 24 家制药公司的有关儿童药物非临床安全性研究的调查中[13] ，根据该调查中提供的给药开始年龄的有限数量的试验，似乎在 1990 年代末和2000 年代初存在一种趋势，在最早的可给药年龄开始给药，而不是在代表发育阶段的年龄开始给药。在 118 项大鼠 JAS 试验中，94 项是在离乳前开始给药，但仅有 23 个受试物拟定患者人群为新生儿，其余均用于 2 岁以上儿童。该趋势在 2006 年初开始转变为更具代表性的年龄，这种转变与 FDA 于2006年发布的指导原则相对应。国内JAS起步较晚，实践经验尚不成熟，采用离乳前动物开展试验存在一定难度，因此常常出现 JAS 试验动物开始给药年龄偏大而不能支持临床试验拟用患者最小年龄的情况。 在 2019 年发表的一篇针对 15 种靶向 CNS 药物的 JAS 研究 ( 均来源于 EMA 儿科委员会的电子文档资料 ) 文献中[14] ，描述了一项动物开始给药年龄偏大的案例。Epi6( 代码，出于商业保护原因未列出产品名称 ) 用于癫痫部分发作性的治疗，拟用患者包括了早产新生儿，在关键性 JAS 试验中，大鼠开始给药年龄为 PND28，从 CNS 发育阶段来看，PND28 大于拟用患者的最小年龄，另外，与PND28 开始给药大鼠相比，从 PND21 开始给药的大鼠毒性严重程度明显升高 ( 基于在年龄更小大鼠中在更低的剂量下发生严重的临床症状而导致终末前安乐死 )，说明在更小日龄的大鼠中毒性更敏感。因此，大鼠从 PND28 开始给药错过了脑发育的敏感关键窗口期，无法敏感地检测到受试物相关的不良影响。 3.3 剂量探索试验 JAS 试验开展难度大，多种因素可影响其试验成败，因此，在正式试验前应考虑进行剂量范围探索 (dose range-finding，DRF) 试验，S11 推荐以小组别的幼龄动物进行 DRF 试验，评估与暴露量和年龄相关的耐受性，这对离乳前开始给药的正式JAS 尤其有价值，可避免大部分由不相关暴露量所致的意外死亡或过度毒性。DRF 应在正式 JAS 中所计划动物起始年龄的最小年龄给药，以评价耐受性和暴露量差异的最关键时期。在正式 JAS 中，给药方案应使在所担忧的发育期间能达到和维持相关暴露量。若动物吸收、分布、代谢和排泄 (ADME)系统的成熟导致系统暴露量发生明显变化，应考虑正式 JAS 过程中进行剂量调整 ( 增加或减少 )，以使暴露量保持在某种程度的一致性和临床相关性。通常在 JAS 期间剂量调整预计不会超过一次[1] 。 POSOBIEC 等描述了一个基于 DRF 结果在正式JAS中进行剂量调整的一个案例[15] 。在该案例中，为支持 3 月龄至成年患者人群的用药，计划开展一项于 PND7 ～ 45 给药的大鼠 JAS。由于在成年大鼠毒性试验中观察到可能与药理学作用相关的卵巢毒性 (每天 0.02 mg/kg)，故将 JAS 给药期持续至雌性大鼠预期性成熟前，使 JAS 与成年动物毒性试验的给药期有重合，并在 JAS 中对性成熟动物评估动情周期。首先进行了一项大鼠 PND7 ～ 21 给药的探索性试验，剂量≥ 0.1 mg/kg 时可见严重毒性 ；接着，进行了一项大鼠 PND7 ～ 35 给药的初步剂量探索试验，给药剂量为 0.01、0.02 和 0.05 mg/kg，并于 PND13、21、35 进行毒代检测，可见给药期间药物暴露量出现急剧下降，在终末时间点 (PND35)3个剂量下的暴露量接近，并且低于预期的临床暴露量。接下来进行了一项剂量范围试验，大鼠分为 2 组，于 PND7 ～ 21 均给予 0.05 mg/kg，为探索如何在发育后期阶段更好地保持暴露量的一致性，在PND22 开始增加剂量，一组增加到 0.08 mg/kg，另一组增加到 0.17 mg/kg，调整后 2 组的暴露量呈现明显的区分。最后综合以上剂量探索试验结果，在正式JAS中，大鼠于PND7～21给药剂量为0.012 5、0.025 和 0.05 mg/kg，从 PND22 开始将剂量增加为0.08、0.17 和 0.35 mg/kg。通过这种剂量调整设计，使暴露量与成年动物高剂量 ( 雌性 0.08 mg/kg、雄性 0.2 mg/kg) 有重合，同组大鼠在发育过程中药物具有相对一致的暴露，3 个剂量组的暴露量得以区分，从而可观察剂量 - 反应相关性，并且中、高剂量组暴露水平也涵盖了预期临床暴露量 370 ng·h - 1 ·ml -1。 3.4 终点指标选择 JAS 终点指标包括核心终点指标和附加终点指标。核心终点指标中，除一般毒理学指标外还包含了生长 ( 体重和长骨长度 ) 和性发育 ( 例如，啮齿类雌性动物阴道张开时间和雄性包皮分离时间 ) 等指标。另外，为了阐述已确定的担忧，应基于 WoE 评价中所确定的担忧类型和强度来确定纳入附加终点指标，附加终点指标包括其他生长终点、骨骼评估、临床病理学、解剖病理学、眼科检查、CNS 评估、生殖评估和免疫评估等。由于神经发育毒性 (DNT)安全性风险高，在临床试验或上市后监测中难以检测到，CNS 评估是 JAS 研究中经常附加的终点指标，尤其是对于具有 CNS 活性的药品。 一项研究对 2009 年～ 2014 年间 FDA 审查的NDA 申请中具有 CNS 活性的 32 种药物共 44 项JAS 试验进行了总结分析[16] ，大多数药物 (20/32)进行了一项大鼠 JAS，部分药物 (11/32) 进行了大鼠和犬 2 种种属的 JAS，仅一种药物 (1/32) 进行了一项犬 JAS。在所有的 JAS 中都包括标准的一般毒理学参数和生长发育指标，通常还进行了扩展的神经组织病理学评估、骨密度测量、生殖评估、神经行为学 /CNS 功能评估。由于是具有 CNS 活性的药物，超过一半的试验 (25/44) 包含了扩展的神经病理学评估，而其余试验 (19/44) 进行了常规的 CNS组织病理学检查。由于药物暴露发生在儿童患者骨形成和生长的动态时期，骨发育也是 JAS 的重点。有 23 项试验设置了特定的骨发育终点 ( 除组织病理学外 )，其中，14 项试验 ( 包括 8 项大鼠和 6 项犬试验 ) 评估了骨长度和骨密度 ( 双能 X 射线骨密度测定法 )，9 项试验 ( 大鼠试验 ) 仅包括骨长度。生殖评估方面，所有大鼠试验 (32 项) 中评估了交配和妊娠结局指标，所有大鼠和犬试验 (44 项) 都进行了生殖器官组织病理学评估，在 16 项大鼠和犬试验中进行了精子分析。 在神经行为学 /CNS 功能评估方面，采用了多种神经学和神经行为学测试，其检测指标因种属而异，主要包括犬的神经系统检查或功能观察组合(FOB)，以及大鼠中更特异性和定量的评估，例如运动活动、听觉惊吓行为以及学习和记忆的检测。所有 32 项大鼠试验均使用自动化系统进行了一项或多项学习和记忆测试，且大多数试验测定了运动活动和听觉惊吓行为。在大部分的大鼠 JAS 中，使用复杂的水迷宫评估了是否导致长期认知障碍，包括 Morris 水迷宫 (11 项)、Biel 水迷宫 (8 项) 和 Cincinnati 水迷宫 (8 项)。 这些 JAS 为儿童用药提供了安全性信息，并纳入了说明书中 (78％) 以提示风险，其中较常见的 CNS 影响是神经行为学异常，包括运动活动、听觉惊吓反射以及学习和记忆的变化。在纳入说明书中的神经行为学影响中，54％的试验发现这些影响是持久的，提示具有神经发育毒性。 4、总结 为支持儿童用药开发的非临床安全性评价对申请人、试验研究者都存在挑战，一方面是由于儿童药物开发中非临床 / 临床试验设计、实施具有难度，另一方面是对已有研究信息的综合评估能力的要求。JAS 可为儿童人群的风险识别和表征提供重要的参考信息，且能阐述与特定发育时期药物暴露风险相关的安全性担忧，是儿童用药开发的非临床安全性评价重要方法。在证据权重分析 (WoE) 基础上，具体问题具体分析，根据前期所获得的各方面信息进行整体地、科学合理地设计 JAS，并且保证试验过程的良好实施，才能够获得有价值的毒理学数据，以支持儿童临床试验的开展，保障儿童受试者的安全。 免责申明 文章版权归原作者所有，经编辑发布主要用于学习交流，如涉及作品内容、版权或其他问题，请联系我们进行删除。 文章内容为作者观点。 特此声明！

药审要点 ｜ 中药新药非临床安全性研究和评价的思考 文章来源：中国药理学与毒理学杂志2016 年12 月第30 卷第12 期：1343-1358 中药新药非临床安全性研究和评价的思考 岑小波1，韩 玲2 （1. 四川大学华西医院/临床医学院国家成都新药安全性评价中心； 2. 国家食品药品监督管理总局药品审评中心） 摘要：安全、有效和质量可控是药物的三大基本要求，中药也不例外。在当前生命科学、医学和药学迅猛发展的时代，中药也迎来发展的崭新时代。面对中药悠久的文化沉淀、现代药理毒理学、当代相关国际技术法规以及人们对药物安全性的期待，如何科学合理地研究评价中药尤其是复方中药，已成为中药研发的一个关键。本文主要阐述当前中药非临床安全性研究的技术要求，重点分析复方中药非临床安全性研究的技术难点与特点。结合笔者对药物安全性研究和评价的认识与实践，对中药安全性研究和评价的技术要求和重点关注领域等进行阐述。 关键词：非临床安全性评价；中药；毒性 中药作为传统医药历经千年的人体应用，为华夏子孙的生命健康做出巨大贡献。如今，中药已经发展形成了成熟的理论体系，如炮制、药性、配伍和方剂等，极大地促进中药的继承与发展。长期以来中药被认为具有“安全、低毒”的特质，使有些研发者不重视中药的安全性研究。近10 年来，随着中药不良反应报道日益增多，人们对中药安全性越来越关注，如马兜铃酸事件、龙胆泻肝丸事件、鱼腥草注射液事件和云南白药事件等。国外也不时有中草药毒副作用的报道，如欧洲减肥中药引起肾衰、日本小柴胡汤引起的“间质性肺炎”和新加坡“黄连毒性事件”等，这些事件在国际上引起较大影响。另一方面，随着药物毒理学的发展和新技术新方法的应用，也发现越来越多的中药具有毒性，如柴胡、独活、黄芩、吴茱萸和千层塔等中药以及小柴胡汤、斑秃丸、加味逍遥散和痔血胶囊等中药复方制剂［1-2］。如何科学研究评价中药的安全性已成为制药工业界、研发机构、学术界及药物审评机构的关注点。 安全、有效和质量可控是药物的三大基本要求，中药也不例外，药物安全是关乎国计民生的大事。近10 年来，制药工业界进一步强化实施规范化的中药材种植、严格的质量标准及标准化提取加工工艺，学术界加强中药非临床安全性的科学研究及技术创新，药品监管机构重视中药新药的科学审评与上市前后的安全性评价及不良反应监测，这些举措对保障中药安全性均起到非常重要的技术支撑与政策保障作用。引起中药不良反应的因素比较多，也比较复杂，包括中药材问题（如重金属和农药超标）、不当的中药材加工炮制、不当的临床应用（超期使用，超量使用，未辨证论治）以及与化学药的相互作用等［3］。这些内容不在本文中阐述。 目前，我国《药品注册管理办法》中，对中药新药分类包括中药和天然药物，其中中药新药又包括了民族药。不同的中药新药根据成分组成或处方组成不同又可分为单味药制剂（如有效成分、有效部位新药）和复方制剂。在各种类别的中药新药中，复方中药最富有哲学与医学的科学文化，也最能体现中药临床应用优势和特色的，是中药新药研发关注的重要领域。本文将重点讨论复方中药的非临床安全性研究和评价。 1 中药非临床安全性研究的技术内容 无论对于中药、天然药物、化学药物及生物技术药物，非临床安全性研究的目的都是相同的，即旨在发现药物毒性与毒性靶器官，寻找毒性剂量与安全剂量，权衡药物进入临床的人体受益与风险，为药物进入临床研究提供科学依据。因此，为保障药物进入临床试验的人体安全性，在非临床阶段应尽量采用全面、科学、灵敏和规范的策略、方法及技术以发现药物的潜在毒性，已成为国际社会的共识。只有全面发现并识别药物毒性，才能预测药物进入临床后患者的风险，才能有针对性地制定药物毒性的监测方案及防控措施，中药也不例外。非临床阶段药物毒性的发现并非简单成为药物研发成败的判决，而是需要综合权衡的分析判断。因此，需树立科学的药物毒性认识观，清晰认识药物毒性研究的目的及安全性问题的本质内涵。 药物非临床安全性研究主要包括2种动物种属的单次给药与反复给药毒性试验、毒代动力学试验、安全药理学试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、依赖性试验、局部毒性及过敏性试验等。中药新药尤其是复方制剂的非临床安全性评价，按照现行的《药品注册管理办法》及相关技术要求，相对于化学药来说要求并不全面。例如，对于中药复方一般只要求1 种动物（一般是大鼠）的单次与多次给药毒性试验，且在特殊毒性（生殖毒性、遗传毒性以及致癌性）、毒代动力学和安全药理等方面的研究评价方面，尚无统一的要求。但对于含有毒性药材的复方中药，或者当大鼠毒性试验出现明显毒性时，需采用第2 种动物种属进行重复给药毒性试验。 在过去10 年中，笔者带领的团队在GLP 条件下完成60余个中药复方的非临床安全性研究，其中约30%受试复方中药发现毒性。其中采用现代提取工艺（如大孔树脂提取、超临界CO2 萃取）制备的中药复方，出现毒性反应的比例相对较高，这与现代提取制备工艺导致药物成分或（和）毒性成分的富集密切相关。分析所出现的毒性靶器官与毒性特征可以看出，肝和肾毒性仍是中药复方的主要毒性，肝和肾是主要的毒性累及器官，其次为胃肠道、免疫系统、造血系统、生殖系统和皮肤等。内分泌系统、脾、心脏和肺的毒性也在个别试验中发现。此外，在中药新药注册申报的评审过程中，也发现了一些值得关注的问题。如改变传统应用工艺后出现毒性、含毒性药材的复方中药出现预期或非预期的明显毒性、不含毒性药材的常用药材组成复方后出现非预期毒性等。从实验研究与审评的实践情况看，当前中药的非临床安全性并非想象中的那么乐观。如何科学、客观地研究评价复方中药毒性，已成为中药复方继承与创新发展的关键环节之一。是否应针对不同处方的中药特点，结合以往的临床应用经验及工艺是否有改变等情况进行分层及分阶段的研究探索是需要思考和函待解决的问题。 2 中药非临床安全性研究的技术特点和难点 2.1 毒性试验给药制剂的质量控制 中药质量控制体系的科学性影响中药非临床安全性的研究质量及结果外推。为了保证毒性试验受试样品的质量、稳定性、含量准确性能够充分代表进入临床（或上市）的样品或药物，GLP 毒性试验一般都要求给药制剂含量、均一性及稳定性的分析，以确保给药制剂的剂量准确且质量稳定，从而保障毒性试验结果的可靠性和可重复性。除了委托方应提供详细的供试品质量检验报告外，供试品分析包括以下内容［4］：①给药制剂的稳定性和均一性。若供试品需经溶解（混合、混悬或溶解）后给药，应检测配制后供试品在溶剂中的稳定性和均一性，且浓度范围能覆盖全部毒性试验的浓度范围。对配制过程和配制后可能影响稳定性的因素也应进行考察，如溶媒、浓度、搅拌方法、温度和配制后储存时间等，以确保给药制剂的稳定性满足实验要求［4］。化学药物所有或绝大多数成分的稳定性与均一性能够被检测，因此常通过给药制剂稳定性研究决定毒性试验过程中的配药频率。但由于中药复方制剂常常缺乏全部或大部分药物成分配制后的稳定性数据，因此建议尽可能给药前现配，以减少对未检测成分稳定性的影响。②浓度分析。检测配制后供试品的浓度。一般在毒性试验首次给药、末次给药时进行给药制剂的分析。对于实验周期较长（如6~9 月）的毒性试验，可以在试验中期增加分析频率。在进行正式毒性试验前，需对上述检测方法与内容进行验证，验证通过后在正式试验中严格按照确定的试验方案实施。给药制剂配制与分析的准确性与全面性，直接影响非临床安全性试验结果［2，4］ 。由于中药成分复杂，溶解性差，质量控制指标不够全面和完善，只能反映有限的指标性成分，对于其他未检测的药物成分，其含量、稳定性和均一性都是未知的。在给药样品配制过程中，应避免加热和长期搅拌等可能使中药成分产生变化的外在因素。此外，长周期毒性试验的样品需求量大，有时为多批样品，即使控制指标成分在不同批次样品是一致性的，但也无法证明其他未检成分的一致性。因此，由此带来的毒性效应的差异难以预测，尤其对于质控指标成分含量比例较低的复方中药，这是中药毒性试验给药制剂分析的难点，不像化学药物能够全面反映给药制剂的药物含量及稳定性。 工艺稳定性是保证受试样品物质基础一致性的基础，不稳定的生产工艺可能导致不同批次的样品质量不一致，导致安全性试验结果也出现差异［5-6］ ，尤其当工艺变化带来物质基础的差异不能通过含测指标的检测加以反映时。溶媒选择也要慎重，这不仅保证所配制给药制剂的均一性，有时也能对试验结果产生影响。有些添加特殊辅料的中药制剂，其药物成分的体内释放与吸收可能与原料药（中药浸膏）存在较大差异。在这种情况下，应尽可能采用含有特殊辅料的中药制剂进行毒性试验，但同时需要考虑单独设立辅料对照组以排除辅料对试验结果的干扰。此外，毒性试验期间供试品的合理保存也是一个重要环节。试验样品如干膏可能存在吸潮性，一些未知成分对光、对高温的不稳定性等。因此，需要充分考虑在整个毒性试验过程中样品保存的科学合理性。 2.2 部分中药质控成分与安全性关联性差 不考虑药物代谢产物等因素，对于单一成分的化学药物，发挥药效学与毒性效应的大多为同一成分。复方中药常常采用多糖、总黄酮、绿原酸、总皂苷和总生物碱等作为质控指标，这些指标可能与药理作用存在一定关联性，但与潜在的毒性效应可能存在关联性，但也可能缺乏关联性、甚至无关联性，从而导致对药物安全性的控制缺乏实际意义。复方中药的一些质量控制指标常常是“不低于”，似乎是含量越高越好。当这些指标成分为安全性较高的成分时，对药物毒性试验结果及安全性评价可能影响不大；但当这些成分具有潜在毒性时，这种质量控制对毒性试验结果及安全性外推影响较大。采用成分含量低的中药制剂进行毒性试验时，可能出现“假阴性”结果，低估了毒性；当采用含量高的中药制剂进行毒性试验时，可能出现“假阳性”结果，即高估了毒性，影响中药研发的判断与审评。例如，山豆根具有肝肾毒性，其中所含的氧化苦参碱或（和）苦参碱可能既是有效成分，也是毒性成分［7］ 。如果该成分以“不低于某一含量”作为药学质控指标，当临床试验样品中该成分含量超过毒性试验用样品时，毒性试验样品不能充分反映今后临床试验或上市的中药，则可能出现临床安全性风险。另外，由于中药药味多，有时毒性成分虽然基本明确，但不少成分缺乏相应的对照品而难以检测。例如，对千里光的质量检测，我国以阿多尼佛林碱为对照品，而欧美认为千里光中所含的肝毒性生物碱成分除了阿多尼佛林碱以外，还有倒千里光裂碱等其他生物碱成分［8］ 。因此，当毒性成分指示指标不够完善、全面时，中药成分的变动可以使毒性试验结果预测临床不良反应风险的可靠性降低。 2.3 动物给药量大带来的试验干扰 中药临床使用剂量一般都比较大。在非临床安全性试验研究中，为了达到较高的药物体内暴露量，毒性试验的设计剂量较高，可达临床拟用剂量的数十倍甚至上百倍。受到动物给药体积的限制，有时只能采用最大可给药剂量（最大可以通过灌胃针、最大可灌胃体积）作为高剂量。而大剂量下（尤其是最大可给药剂量）毒性试验的结果存在一些问题：①由于给药剂量过大，影响了特定药物成分（尤其是含量不高的毒性成份）的吸收，从而影响药物毒性的暴露。对于化学药物，可以通过伴随毒代动力学实验分析药物吸收与体内暴露水平，而中药难以开展伴随毒代动力学的研究明确药物成分暴露水平。②在中药毒性试验中，常观察到高剂量组动物体质量降低，但有时难以区别这是药物的毒性效应还是灌药量大对动物摄食的干扰。大量给药量可引起动物胃肠道应激反应，造成的腹泻和食欲减退等［6］，可能影响动物营养吸收和正常发育，干扰试验结果，从而影响对中药安全性的判断。③大剂量给药量可能造成药物成分的吸收反而低于低、中剂量，尤其对于具有胃肠道刺激的中药，大剂量反而刺激胃肠道，加速排空，使药物在胃肠道停留时间短、未能充分吸收前就排出体外。因此，有时可以观察到中剂量组动物的毒性反应高于高剂量组的情况。综上，中药毒性试验中，过高剂量给药可能带来干扰，研究者需要在实验中总结经验，在保证不影响动物正常发育、不影响药物吸收等情况下，确定最佳毒性试验的给药剂量。 2.4 外用制剂非临床安全性研究的难点 外用制剂是指不经口服和注射给药，直接用于皮肤、黏膜或腔道的制剂，如常用的贴剂、膏剂、涂剂和喷雾剂等。外用制剂是中药制剂的特色之一，但常含毒性药材，如马钱子、川乌和草乌等。中药外用制剂药味多，成分复杂，且动物皮肤与人体皮肤（黏膜）在组织结构、生理特性和药物吸收等方面存在较大差异。因此，外用中药复方在毒性试验中如果能够充分模拟临床实际情况，如药物透皮吸收、药物与局部相互作用等，对于药物安全性的研究评价较为重要。当中药成分在动物体内缺乏暴露而在人体存在暴露时，动物试验结果难以预测人体毒性效应。 外用中药制剂非临床安全性研究的难点体现在以下方面：①药物成分经皮吸收较低时，对于化学药物与生物技术药物，可以考虑采用皮下注射的补充途径增加药物体内暴露。但外用中药制剂多为粗制剂，难以开展皮下注射，因此难以研究药物充分体内暴露下的毒性效应。一些外用制剂适用于破损皮肤，如何长期反复破损动物皮肤（黏膜）以增加药物吸收而又不损伤动物、干扰主试验，存在诸多技术难点［9-10］。外用制剂可选择小型猪、家兔和大鼠，但目前中药制剂较多选择大鼠和家兔，小型猪使用较少，而小型猪皮肤生理结构与人体最接近。②通过药代或毒代动力学试验获得经皮（黏膜）吸收中药成分的体内暴露信息目前存在较大难度，有主观原因也有客观原因，如当前技术法规的要求和检测技术难度大等。但对某些中药成分具有较大的安全性担忧时，应考虑毒性试验伴随毒代研究，以阐明药物体内暴露水平-毒性的量效关系。如马钱子中的生物碱士的宁和马钱子碱等具有神经、心血管系统毒性，检测这些成分的动物体内暴露水平并与毒性效应进行关联，对于准确评价药物安全性具有重要意义。③膏剂和贴剂等制剂存在载药量限制，有的外用制剂对动物皮肤接触性差，影响药物的经皮吸收。此外，受到动物可给药皮肤面积的限制，不能完全依靠增加给药面积以增加药物吸收。④如何保证外用制剂在给药部位的保留/停留时间是受试物能否充分暴露的因素之一［9］。例如，经腔道（阴道、鼻腔和直肠）途径的毒性试验，如何保障药物不会外流或排出、增加在腔道内的停留时间，是实验成败的关键因素之一。⑤动物毒性试验中，皮肤黏膜经常出现的局部症状如红斑和水肿等，有时难以辨别是药物刺激性还是过敏性所致，需要更深入的免疫毒理学研究才能加以甄别，如特异类型淋巴细胞的比例和腘窝淋巴结试验等［11］ 。 2.5 药效或药理关联效应在毒性试验中的缺失 化学药物或生物技术药物的非临床毒性试验中，往往观察到与药物靶点、药理作用机制和（或）药效学关联的毒性效应，这些毒性效应大多是放大的药效学效应、继发性效应和（或）药物的脱靶效应，都与药物自身相关，大多能够通过药效学、药理机制分析所产生的毒性及其机制。但是，在复方中药的药理学和药效学实验研究中，检测指标大多是抗氧化、抗炎、免疫调节、调节血糖（血脂）、改善微循环和激素（内分泌）调节等相关指标，从发表文献或新药申报资料均显示具有良好的药效学效应，相关检测指标显示良好的预期改变，有的中药复方甚至优于对照的化学药物，但这些药理或药效学效应在毒性试验中常常未能观察到。从笔者多年所研究评价中药的情况分析，仅少数中药表现出药效学关联的一些效应，如降血脂中药复方在毒性试验中动物可以表现出体质量减轻和甘油三酯降低的效应；具有免疫抑制作用的中药，在大鼠上可以观察到胸腺和脾脏萎缩和（或）淋巴结异常。上述现象的原因较为复杂，原因分析如下。 2.5.1 未能科学合理地设计针对性、指示性的毒性检测指标 由于对中药复方的药效物质基础与毒性成分不够清晰，加上研究者对药物毒性的预测分析力弱，往往难以设计科学灵敏的毒性检测指标，依赖肝肾功、血糖和血脂等常规指标难以反映药物的隐匿性毒性，尤其是早期、轻度的毒性发生时。中药疗效一般较为温和、缓慢，因此其毒性效应可能是一种远期效应，较为轻微，在这种情况下，科学合理地设计灵敏指标或早期生物标志物以探测潜在毒性，实际上对于中药毒性研究更应重视、更具有实际价值。例如，检测反映肾小球滤过功能的血清β2 微球蛋白与血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、反映肾小管功能的β2 微球蛋白、α1 微球蛋白及肾损伤分子1 等毒性标志物，可以更灵敏、早期地的识别肾损害，尤其是早期的功能变化，可以反映损伤位点与毒性机制。因此，较常规的血清肌酐和尿素氮更具有较好的先进性。这些毒性标志物现已成为美国FDA 或EMA 推荐的检测指标。 此外，复方中药药效学研究结果的可靠性也是较大的干扰因素。不可靠的药效学指标与结果有时会误导向毒性试验的桥接与转化，使毒性试验的设计指标既难以反映药效学作用、也难以探索到预期毒性。 2.5.2 复方中药的双向调节作用 中药的双向调节作用与其中所含的复杂成分与机体的相关作用有关。有些中药复方含有药理作用相互对立的药效成分，在不同病理条件下产生不同的药理作用，表现出双向调节作用。在毒性试验中，当药物作用于正常健康动物机体时，不同效应相互抵消。因此，中药药理或药效学的相关效应未能表现。例如，辛温解表的代表方剂麻黄汤中既含有兴奋中枢神经的麻黄碱，也含有抑制中枢的抑制成分桂皮醛；既含有扩张血管的成分桂皮油，又含有收缩血管的成分麻黄碱［12］。一些复方中药由于不同配伍呈现相反的药效学效应，例如四君子汤中的水溶性成分兴奋胃肠平滑肌，而脂溶性成分抑制胃肠平滑肌运动，两者协调则可以双向调节小肠运动 ［12］。桂枝汤的活性成分Fr.A 和Fr.E 能降低自发性高血压大鼠血压，而活性成分Fr.B 能升高低血压大鼠血压，表明对血压的双向调节作用［13］ 。 2.5.3 中药的“倒钟型”效应 中药的“倒钟型”效应，即在一定剂量范围内表现出一定的药效学效应，但超过一定剂量后药效学效应反而降低，甚至丧失。以受体、酶和离子通道为靶标的药物可以表现出“倒钟型”效应：低剂量时激活这些靶标、产生相应的生物学效应，到达一定剂量后达到稳定的“平台”效应，再提高剂量后则产生抑制靶标的效应。这与不同剂量药物成分对靶点的激动或抑制效应、构像调节、脱敏效应、受体内在化效应以及占位饱和等不同的作用机制相关。毒性试验通常采用较大剂量给药以暴露药物毒性，在“倒钟型”效应的情况下，毒理学或放大的药效学效应可能表现不明显。 3 人体应用经验在复方中药安全性研究评价中的价值 复方中药制剂区别于化学药物、生物技术药物最大的特点是复方中药是在中医指导下的辨证施治，具有临床人体应用历史。一些经典名方、验方历时数百年的人体应用实践，累积了一些人体应用的信息资料，对其安全性有了初步了解和把握。对中药毒性的认知，有理解为中药对机体的损害，也有理解为中药偏性及由此产生的治疗效应。对于中药的非临床安全性研究，听到的一些争论是：人都“点头”了，还需要老鼠“点头”吗？言下之意，经过了临床人体实践的中药，还需要动物实验来裁决吗？不容否认，来源于临床实践的中药复方能够提供人体安全性的一些信息，为指导中药新药研发与临床试验提供有益的指导，对支持早期临床试验（如短时程的人体耐受性试验）可能具有较大价值。但对于支持扩大的临床试验（如长周期的临床试验和特殊人群等），降低或者简化中药非临床安全性的技术要求，除非有充分的科学依据，原因简要分析如下。 3.1 临床观察的全面性、科学性和准确性，决定了临床人体信息的价值 来源于临床的中药复方具有一定临床应用基础，但大多数临床观察并非遵循随机、对照、双盲的科学原则，往往是粗略的临床观察，且主要关注的是临床疗效或有效性，而对安全性并未进行全面、科学、细致的观察。对于一些急性或（和）严重的不良反应如急性或明显的肝、肾或胃肠道的毒性及明显异常的神经症状等，在临床实践中容易观察，但对于长期慢性、隐匿性的不良反应，简单的临床观察通常难以识别，如蛋白尿、脏器组织慢性纤维化、肾小管细胞变性坏死和QT 间期延长等。随着药物应用时间的延长，毒性逐渐积累使得脏器功能失代偿、毒性效应明显爆发时才能觉察到。因此，如果缺乏科学、可靠、灵敏的检测手段与技术，隐匿性毒副作用难以通过望诊和问诊等方式加以识别。 3.2 潜在的遗传毒性、生殖毒性和致癌性等特殊毒性在临床实践中难以观察 无论对于中药、化学药物还是生物技术药物，其潜在的遗传毒性（致突变性）、生殖毒性（对亲代生殖功能与早期生育力、对妊娠期胚胎发育及对子一代生长发育的毒性影响）和致癌性等特殊毒性在临床实践中都难以观察。临床人体试验主要考察药物的一般毒性，需关注的是副作用或者危及生命的事件；特殊毒性的考察无论在方法、技术手段、伦理及可行性等方面都难以在临床试验中得到研究考察。例如，遗传毒性发生在基因（DNA）及染色体水平，也可以发生在非DNA（组蛋白）水平——表观遗传机制。遗传物质的损伤肉眼看不见，摸不着，也非人体能够感知，需要借助现代技术手段才能检测到。关木通、广防己及其相关制剂引起的肾功能衰竭和肾肿瘤的事件就是一个很好的例子［14］。马兜铃酸及其代谢物在肾、肺等组织蓄积明显，直接损害肾细胞，导致肾功能受损及慢性间质纤维化。随着科学技术的发展，近年才发现马兜铃酸能够插入肾细胞 DNA 形成 DNA 加合物，从而造成 DNA 损伤。服用积聚量高的患者肿瘤发病率高，在所有几十例患者的肾组织中均检出马兜铃酸-DNA 加合物，有研究提示为马兜铃酸与人p53 基因嘌呤碱基反应［15］ 。这些研究首次从分子机制阐明了马兜铃酸的遗传毒性，为阐明其致肾肿瘤机制提供了科学依据。药物诱导的肿瘤形成是一个长期过程，DNA加合物的识别也只能应用现代科学技术才能发现。因此，不难理解这些特殊毒性需要特定的科学研究才能发现。 3.3 对产生毒性的原因与机制了解甚少 在临床应用过程中，即便发现中药的一些不良反应，也大多停留在对临床事件的了解层面，对产生毒性的原因与机制了解甚少。而非临床安全性研究不仅仅可以识别药物毒性，而且能够通过追加试验，在动物整体水平、细胞水平乃至分子水平深入解析毒作用机制。这对于药物毒性进入临床试验的风险评估、毒性的预防、监测与控制，都具有重要的指导意义 3.4 现代中药提取制备工艺与传统工艺的差异，也会带来安全性的风险或担忧 传统复方中药的提取制备方法主要是煎煮法。一般中药提取技术采用水提、醇沉，但随着现代分离提取技术的发展，形成了大孔吸附树脂法、超临界萃取法和液相气相色谱法等新技术，实现对中药成分的提取、分离与纯化，并达到显著提高特定成分含量的目的。例如，利用大孔吸附树脂分离西洋参果肉总皂苷，可以使总皂苷含量超过50%［16］ 。但需要关注的是，这些现代提取工艺的应用虽然显著提高富集了有效成分，也会使潜在的有害有毒成分浓缩富集；或者使传统工艺未能提取出来毒性成分在新工艺提取出来。 因此，在传统工艺中未显出的药物毒性，在应用现代工艺后药物的毒性可能表现出来。此外，中药复方制剂在炮制、提取等制备工艺过程中，一些成分可能发生改变或者引入新物质、杂质等，都有可能成为复方中药制剂的毒性原因。因此，前人在中药复方的应用中获得有关人体安全性的信息，还需要根据实际使用的制备工艺加以分析。 4 中药新药非临床安全性研究和评价的思考 4.1 复方中药非临床安全性研究技术要求的发展变迁 当前，复方中药一般只要求一种动物（常为大鼠）的单次与重复给药毒性试验（以前称为长期毒性试验），其中重复给药毒性试验对于中药非临床安全性的判定最为重要。对中药非临床安全性研究的技术要求可以追溯至1992 卫生部药政管理局颁布的《中药新药研究指南》，该指导原则指出“对于中药新药制剂，各味药材符合法定标准，无特殊工艺，无毒性药材，一般进行大鼠长毒试验。如无明显毒性反应，则可以免做犬长期毒性”。1999 年，国家药品监督管理局颁布《中药新药研究的技术要求》，其中对复方中药非临床安全性研究的要求与1992 年颁布的技术要求基本一致，但对毒性试验给药周期从“给药期为临床疗程的 2 倍”调整为“3~4倍”，这是一个较大技术要求的提升。2005年，CFDA 颁布中药、天然药物非临床安全性研究的多项指导原则，明确了在GLP 条件下进行中药非临床安全性研究。该指导原则最大的特点与提升是引入了国际理念与国际技术标准，技术要求与FDA 和人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）的相关指导原则基本相同，在实验项目、检测指标以及实验设计的科学性与系统性等方面，质与量显著提升，这对于提升我国中药非临床安全性研究的水平与规范性起到极大的促进作用。该指导原则中指出：“中药复方制剂，可先进行一种啮齿类的长期毒性试验，当发现明显毒性时，再采用第二种动物（非啮齿类）进行研究。若该类处方中含有毒性药材、无法定标准药材或有十八反、十九畏等配伍禁忌时，则应进行两种动物（啮齿类和非啮齿类）的长期毒性试验。2014 年，CFDA 颁布了药物非临床安全性研究的多项指南，没有区分化学药物与中药，但对复方中药的非临床安全性研究评价，在附件进行备注，基本内容与2005 年的技术要求相同。总体来看，中药新药非临床安全性研究评价是在参考化学药物的基础上，学习、借鉴并结合中药复方特点发展形成当前的指导原则。 从上述毒性试验指导原则的变迁可以看出，从1992 年至今，对中药复方非临床安全性研究的技术要求基本没有大的变化，最主要的实验研究仍然是一种啮齿类动物（大鼠）的重复给药毒性试验。在实际研究评价工作中，采用另一动物种属（如犬）进行复方中药重复给药毒性试验的情况较少，只有对含有大毒药材的中药复方或者大鼠毒性试验结果存在不确定的毒性判断时，会要求进行犬重复给药毒性试验。 4.2 复方中药非临床安全性研究技术要求的思考 安全、有效是药物的核心要素。为了保障药物安全，国际社会（尤其是美国、欧洲和日本）历经数十年的科学研究与评价实践，形成较为成熟、完善的药物非临床安全性研究技术体系，为保障药物安全与人类健康发挥巨大贡献。这一现代毒性评价体系是基于现代医学、生命科学、动物医学、组织病理学、临床病理及分子生物学等学科形成的综合性交叉学科与技术体系，适用于所有与人体健康的产品，如药物、农药、食品、化妆品和医疗器械等。尽管对于不同的产品，所要求毒性试验项目、实验内容及检测指标存在差异，但安全性研究的思想与原则基本相同，即采用全面、科学和灵敏的技术方法检测其潜在毒性，预测人体风险。前面已提及，现代药物非临床安全性研究的技术要求主要包括2 种动物种属的单次给药、反复给药毒性试验、毒代动力学试验、安全药理学试验、生殖毒性试验、遗传毒性试验、致癌试验、依赖性试验、局部毒性和过敏性试验等。作为药品上市，安全、有效的共同属性决定了中药复方在非临床安全性研究中的理念与目标和化学药物、天然药物及生物技术药物并无差别。复方中药的中药配伍和人用经验可以提供中药安全性的一些参考信息，但难以取代非临床安全性研究，尤其是慢性、隐匿性毒性的识别；遗传毒性、生殖毒性乃至致癌性的排除，更需要严谨的非临床试验研究。此外，前人对中药复方的临床应用大多建立在辨证论治的个体基础上，而中药成药面对的是庞大的患者群体，不同患者个体在年龄性别、病理生理、药物吸收与代谢、遗传因素、体质与营养状态以及证候改变等方面都不尽相同。因此，系统的非临床安全性研究对于保障用药安全具有重大意义。美国FDA 颁布的《植物药研究指导原则》中指出，植物药的人用经验对于安全性的判定具有参考价值，可支持植物药进入初期临床试验，但对于扩大的临床试验和批准上市前必须有严格设计、完整的非临床安全性研究资料［17］。例如，2006 年美国FDA 批准上市的第一个植物药Veregen，是由绿茶中提取的以茶多酚为主的外用植物制剂。上市前进行了包括安全药理学、局部耐受性、全身毒性、遗传毒性、生殖毒性、致癌性、药代动力学及毒代动力学等多种属、多途径的系列毒性试验研究。 4.3 一般毒性试验中动物种属选择的考虑 两种动物种属的重复给药毒性试验是当前国际业内的共识。啮齿类（大鼠）、非啮齿类（犬）动物具有不同的遗传、生理、生化和药物代谢等特性，因为药物在这 2 种不同种属的毒性效应可能不同。 Olson ［17］等大量的调查与总结表明，采用啮齿和非啮齿2 种动物进行毒理学试验，所表现出来的毒性反应和人体的毒性反应之间的一致性可达71%，而单用啮齿动物毒性试验，其研究结果和人体不良反应的一致性概率仅为43%，单用非啮齿动物的一致性概率为63%。因此，为了增加动物实验预测人体毒性反应的全面性和准确性，保障临床试验受试者安全，美国、欧洲和日本等药品监管部门对药物一般毒性试验都要求采用2 种动物种属进行；支持Ⅰ期临床试验可以进行短周期的毒性试验（如4 周毒性试验），但上市前需完成更长周期的安全性实验，这已经成为全球工业界、药物监管机构及研究者的共识。 由于中药成分的多样性和复杂性，难以通过动物药代动力学和体外代谢研究以筛选敏感的实验动物。长期以来，中药复方新药一般采用1 种动物种属（大鼠）重复给药毒性试验。应用大鼠和犬进行的重复给药毒性试验，各有优点，也有局限性。大鼠与犬相比，动物样本量大，技术操作方便，易于管理。但单独的大鼠毒性试验也存在以下局限：①大鼠毒性试验难以观察药物对心血管系统的影响，如心电图、血压和心率等，如果进一步缺乏对心血管系统安全药理学研究，则可能造成在心血管毒性评价的缺失，因为仅仅靠心血管脏器组织的病理学检查，难以全面评价心血管系统毒性尤其是功能性改变。心血管系统毒性是化学药物常见毒性之一，也是上市药物撤市的重要原因，应予以重视。心血管系统的相关指标可以在犬重复给药毒性试验中伴随观察，而且能够实时动态的监测，如采用马夹遥测技术等。②大鼠对胃肠道药物毒性不如犬敏感，可能造成药物对胃肠道影响的忽视，尤其当缺少胃肠道安全药理学试验时。③群养的大鼠对于神经精神系统的观察不如单笼饲养的犬适宜。犬较容易观察到神经、精神及运动功能的异常。④大鼠重复给药毒性试验周期最长为6 个月，而犬可以做到9~12 月。因为大鼠6 个月毒性试验对于临床用药周期长、或者反复用药的中药新药可能不足，如治疗高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺气肿及肝纤维化等的药物，这种情况下更长周期的犬毒性试验可以更充分暴露药物的潜在毒性效应。在单用大鼠进行的毒性试验中，有时会遇到模棱两可的毒性结果，加上缺乏药物成分、药物体内暴露量和药物作用机制等信息，对安全性的判断陷于两难状况。例如，药物组动物出现轻度蛋白尿的比例略有增加（对照组也有尿蛋白），血清肌酐、尿素氮和肾组织病理等其他所有检测指标均未见异常。在这种情况，只能结合组方药材、有无毒性药材、制备工艺、药理作用、人用史、临床适用人群与适应症以及用药周期等方面进行综合分析，但这些也仅仅是推测分析，缺乏科学依据。判断的科学性更多取决于研究者或审评者的工作经验与科学水平。如果具有另一种动物种属的毒性试验，对这些可疑结果将起到重要的印证作用。 综上，采用2 种动物种属（一种啮齿类，另一种非啮齿类）进行一般毒性研究对于保障药物临床安全性具有重要意义。不可否认，与化学药物不同的是，来源于临床的复方中药新药往往具有或多或少的人体应用的信息，但正如本文前面所提到的，粗略、不规范的临床观察难以获得科学、全面、可靠及可溯源的临床安全性数据，而且对于隐匿性、慢性的毒性损害难以在临床观察中发现。笔者认为只有在获得科学、规范的临床数据的基础上，才能考虑非临床安全性试验的简化或减免。 4.4 疾病模型动物与健康动物应用的思考 病理状态下的疾病模型动物与正常健康动物存在差异，其体质状态与患者可能更为接近。因此，一些观点认为采用疾病模型动物进行毒性试验，与中药强调的辨证施治较为吻合。有研究比较了大黄（主要含有大黄素和大黄酸）在正常大鼠和CCl4肝损伤模型大鼠的毒性表现，发现肝损伤模型大鼠对大黄的毒性反应低于正常动物［19-20］。造成这一现象的机制是肝损伤动物对大黄中蒽醌类成分的组织分布和代谢特征与正常动物不同，肝损伤模型动物肝组织将其他蒽醌成分转化代谢为肝肾毒性相对较大的大黄酸的能力显著低于正常动物肝组织，因此反而不易发生肝肾毒性。有研究也发现，大黄给予正常或肝受损的大鼠连续12 周后，大黄酸、大黄素和芦荟大黄素在肝受损大鼠的肝、脾及肾的水平显著低于正常大鼠，提示肝损潜在毒性降低伤模型动物对大黄［21］。对α 异硫氰酸萘酯诱导的急性淤胆型肝炎大鼠给予一定剂量的赤芍、芍药苷及白芍苷，其体内药代动力学参数如t1/2，AUC0–t，AUC0–∞，tmax及Clz/F 等与正常大鼠也明显不同，这可能是肝损伤大鼠毒性反而降低的原因［22］。这些研究支持了“有病病受之，无病体受之”、《黄帝内经·素问》“有故无殒，亦无殒”等观点。上述研究提示，中药药理学、药效学和（或）药代动力学在疾病模型动物与健康动物的效应可能不同，但目前在这个领域积累的数据很少，尚未形成规律性认识，仅限于很少量的实验研究。因此，当正常动物的毒性试验结果与预期结果（或临床实践）存在较大差异时，积极探索中药在正常动物与疾病模型动物中的毒性差异及其原因，不仅对于中药新药的研发具有意义，而且对于科学解释与认识中药毒性具有重要意义［23］。 当前国际上尚无将疾病模型动物应用于药物毒性试验专门的指导原则，但在ICH 指南中提及疾病模型动物在药物安评中的应用。ICH（2011）指出，或许可以采用模拟临床疾病的动物模型进行药物安全性研究，动物模型可以是自发性也可以是诱发性动物模型，如疾病模型动物、基因敲除动物及转基因动物。疾病模型动物的应用可能对于解释更接近临床实践的潜在毒性与体内代谢具有意义，甚至对判断药物的安全性具有决定性意义，例如是否加重原有疾病［24］。尽管这个指导原则主要针对生物技术药物，但从科学理念来看也应适用于中药。ICH（2005）指出，动物模型或许可以用于心律失常药物的安全性评价［25］。ICH（2009）有关抗癌药物的非临床安全性研究指南中，并未提及模型动物应用，但仍然有一些采用荷瘤小鼠进行安全性评价的实验研究［26］。 4.5 关注肝、肾之外其他脏器系统的毒性研究 肝、肾是药物代谢与排泄的主要器官，其毒性发生概率高于其他脏器。因此，药物毒性试验中比较重视对肝、肾的毒性研究［27］。目前已知具有肝、肾毒性的中药不少，如大黄、吴茱萸、何首乌、山豆根和雷公藤等［28］。大黄所含的大黄素等蒽醌类成分具有肝、肾毒性，何首乌水提组分或醇提组分都具有剂量效应的肝毒性。复方中药报道具有肝、肾毒性的复方中药，如壮骨关节丸、疳积散和青黛胶囊等［29］。肝、肾毒性的识别，除了依靠组织病理学的经典指标外还有血清指标，如反映肝细胞组织结构的谷丙转氨酶和谷草转氨酶，反映肾功能的尿素氮和肌酐等，这也是中药肝、肾毒性相对易于识别的另一个原因。由于中药物质基础的复杂性、毒性作用及其机制的未知性和复杂性，除了肝、肾等常见毒性靶器官外，还应重视对胃肠道系统、免疫系统和生殖内分泌系统等的影响，这与中药多成分、多靶点和多作用机制的特点有关。 胃肠道是口服中药进入体内的首个处置脏器，具有一些特定理化特性的中药对胃肠道可能具有直接或间接的影响。例如，性味苦寒的中药会影响胃肠道的功能；祛风湿药可引起消化系统的不良反应，这可能与其中所含的乌头碱（或其他生物碱）及具有细胞毒性的二萜环氧化合物有关［30］。这类药物应关注胃及十二指肠黏膜上皮的组织病理改变。追加的胃肠道安全药理学试验，如体外回肠收缩和胃排空时间等指标，对于进一步明确药物的作用特点具有帮助。一般情况下，犬胃肠道对药物的刺激或反应的敏感性高于大鼠。中药成分复杂，对免疫和生殖内分泌等多功能复杂系统的影响需关注，尤其含有免疫抑制功能的中药材［31-32］。例如，雷公藤中所含的雷公藤总生物碱和雷公藤甲素等具有明确的免疫抑制作用，昆明山海棠也具有明确的免疫抑制作用，这些作用可以在动物毒性试验中表现出来，如观察到胸腺与脾萎缩、淋巴结病理损害等。中药的免疫增强（激活）的效应在正常健康动物不易观察到，但应该注意一些局部效应。例如，笔者团队进行的某一治疗上呼吸道感染复方中药的大鼠1 月重复给药毒性试验，尽管该中药复方都是常见中药材，但发现肠系膜淋巴结窦内红细胞增多，推测与该药物刺激胃肠道免疫功能有关。心脏毒性也不容忽视。采用基于核磁共振的心脏、肝及血清代谢组学研究发现，蟾酥可引起心肌细胞氧化应激、线粒体功能及能量代谢的紊乱，表明其心脏受损，从机制上解释了蟾酥引起心肌组织病理改变［33］。采用基于UPLC-Q-TOF-MS 的代谢组学研究黑顺片及其联用瓜蒌、浙贝母、白莲或白芨等的心脏毒性。结果发现，黑顺片或其联用复方都可引起心肌代谢组异常［34］。附子和贝母在临床常用于心肺相关的疾病，但按照中药配伍理论，由于附子和贝母不合，不能配伍使用。在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠中，附子和贝母合用可以改善肺动脉高压早期大鼠的肺功能和肺病理变化；但随着疾病进展至晚期，右室扩张及心肌细胞凋亡反而加重，这与抑制3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶以及激活蛋白激酶A 介导的信号通路等机制有关［35］。 笔者团队研究评价过的中药新药，尽管都是一些常见中药材组方的复方中药，但也会发现一些不常见的病理变化，这些改变可能与复杂、未知的中药成分有关。例如，某一拟用于治疗肝损伤并伴有转氨酶升高的复方中药，发现大鼠子宫内膜增生和子宫内膜呈分泌期改变；某一治疗糖尿病复方中药的毒性试验中，发现大鼠脱毛、表皮增生和毛囊萎缩等；某一治疗肠易激综合征复方中药的毒性试验中，发现大鼠股二头肌纤维变性萎缩，大鼠后肢无力。这些毒理效应难以从中药成分、药理作用机制或药效学等角度进行科学分析，是中药毒理学的研究难点。中药新药的研发一般以注册申报上市为目标，许多研发单位一般不愿投入资金进行毒性机制的探索研究，且一旦出现明显毒性后研发单位即终止试验。因此，有关中药新药毒性及其毒性机制的文献报道非常少。综上，除肝、肾等常见药物毒性靶器官，中药新药对于其他器官系统的毒性研究也不容忽视。 4.6 关注生殖毒性 生殖毒性关系到人类生殖健康以及下一代的成长与健康，应给予足够重视。自从20 世纪沙利度胺（反应停）所致“海豹儿畸形”的惨剧发生后，国际社会对药物生殖毒性的研究内容与技术要求不断完善，形成了目前较为系统的生殖毒性研究技术体系，研究内容包括从早期生育力（生殖细胞和生殖能力）、胚胎发育（致畸敏感期）到子代发育（围产期）的生育与发育过程。正是由于现代药物生殖毒性试验体系的建立与实施，“海豹儿畸形”事件发生后在全球范围内再未出现重大生殖毒性的“药害”事件。 中医妇科是中医药的特色专业，古代医者较为重视中药的生殖毒性，根据临床经验编制“妊娠禁忌歌”，在一些复方中药记载妊娠禁用、忌用或慎用，体现了对生殖毒性进行风险等级控制的意识。明显的生殖毒性如早产和流产等，容易在临床中观察，但大多数生殖毒性无法在临床中进行研究与识别，如生殖细胞（精子和卵细胞）的发育与成熟、受精卵着床、早期胚胎发育、胚胎畸形（外观、内脏和骨骼畸形）、子一代发育与精神神经功能等，基本依 赖于非临床生殖毒性的实验研究。目前对复方中药尚未要求进行生殖毒性研究，只有对保胎、促孕和性功能障碍等特定适用人群的中药要求进行部分生殖毒性试验研究，如大鼠生育力与早期胚胎发育生殖毒性试验、大鼠致畸敏感期生殖毒性试验等。没有经过规范生殖毒性的试验研究，就没有数据科学评价中药的生殖毒性。对于化学药物如此，中药同样也如此。 有学者调查研究了台湾市立妇女儿童医院1984-1987 年入院孕妇（妊娠期大于26 周）的用药历史、分娩和新生儿状况等，共计分析了14551 例新生儿。排除混杂因素后，发现在妊娠第一个周期服用过黄连的孕妇与增加的胎儿神经系统畸形风险有关，服用过安胎饮的孕妇与增加的骨骼肌及结缔组织畸形风险有关［36］。多种中药材的生殖毒性已被现代实验所证实，如茵陈蒿、川桂皮、牡丹皮、苦参、山慈菇、半夏、水蛭、杜仲、雄黄、千里光、紫草、红花、大黄、大戟、扶桑、九节菖蒲、羌活、洋地黄和连翘等。例如，半夏及其炮制品具有小鼠胚胎毒性，以生半夏为甚［37］；大黄具有较强的大鼠生殖毒性［38］；高浓度（大于15 mg·L-1）人参皂苷Rb1 可直接导致大鼠胚胎畸形［39］。山慈姑对生殖细胞有较强的致突变作用［40］。中药生殖毒性的原因可能与其中所含的一些成分有关，如生物碱、苷类、毒蛋白、动物毒素和酚类等。例如，雷公藤中所含的雷公藤总生物碱、雷公藤多苷及雷公藤甲素等具有明显的雄性生殖毒性，具有睾丸毒性，引起睾丸病变［41］。含毒蛋白类的天花粉、含毒素的僵蚕和含酚类的酚酸等具有明显的生殖毒性；含重金属有机汞、砷之类中药的生殖毒性也不容忽视［41］；麝香酮具有终止妊娠的作用［42］。对盐附子、生川乌和生草乌的大鼠生殖毒性研究，发现可引起睾丸和附睾脏器系数减小，但睾丸组织未见异常［43］。有学者研究了20 种孕妇常用中药材对小鼠的生殖毒性，如白术、菟丝子、续断、阿胶、桑寄生、甘草、黄芪、白芍、当归、杜仲、党参、山参、生地黄、艾叶和陈皮等，其中一些中药材可观察到有益的效应，如促进胎鼠身长、增加一窝胎仔数量等，但一些中药也观察到毒性效应，如妊娠早期的生殖毒性，尤其是增加母鼠围产期死亡率［44］。采用胚胎干细胞研究黄白术、板蓝根和黄连的致畸性，黄白术和板蓝根未见胚胎毒性，但黄连具有弱的胚胎毒性［45］。综上，没有经过规范生殖毒性的试验研究，就没有数据科学评价中药的生殖毒性。对于化学药物如此，中药同样如此。中药复方生殖毒性的研究报道较少，这可能与长期以来对中药生殖毒性的不重视有关。昆明山海棠胶囊具有一般生殖毒性［46］；千里光及其复方制剂千柏鼻炎片对大鼠胚胎具有致畸作用［47］。笔者团队在风湿平胶囊大鼠I、II 阶段的生殖毒性试验中，发现雄鼠睾丸生精细胞发育不良、精子减少及精子畸形，干扰雌鼠受精卵着床、引起胎鼠骨骼发育缓慢。上述研究结果可以看出，对于含有毒性药材或具有潜在遗传或生殖毒性药材的复方中药、具有免疫抑制效应的复方中药，进行生殖毒性试验研究具有重要意义。除此之外，对于含有干扰细胞代谢成分的中药、含重金属的矿物药、有较强活性的活血化瘀药、泻下药、破气药、辛热药和滑利药等，也应结合临床适用人群考虑进行生殖毒性试验，以排除潜在的生殖风险。实际上，中药新药复方制剂审评过程中也暴露出一些常用中药材的组方存在生殖毒性的情况，如对雌雄大鼠生育力的不良影响、延迟胎鼠的骨骼发育等。 胎盘屏障对药物成分的阻隔功能不如血脑屏障，大多数物质都能够进入胎儿血循环，可能对胎儿发育造成损害。例如，巴豆水提取液能够通过小鼠胎盘屏障，诱发骨髓及胚胎肝细胞染色体损伤［48］。因此，对于适用于妊娠期妇女的复方中药，进行致畸敏感生殖毒性、围产期生殖毒性试验对于保障妊娠与胎儿安全、子代健康都很有必要。 4.7 关注遗传毒性 药物遗传毒性是指各种作用机制直接或间接引起遗传物质DNA 的损害，从而引起体细胞或生殖细胞的突变。遗传毒性可以导致致癌性、致畸（胚胎致死和胚胎畸形）、代谢障碍分子病及生殖障碍等遗传性疾病。一方面，药物的遗传毒性涉及致癌和致畸性，也涉及子孙后代的健康，是一种远期与隔代效应；另一方面，遗传毒性的损伤水平发生在基因水平，这类毒性效应在临床难以识别与防控。遗传毒性试验致癌预测性为60%~90%，90%以上致癌物遗传毒性试验为阳性结果。因此，遗传毒性试验是药物非临床安全性研究评价的重要内容。药物遗传毒性主要通过组合毒性进行测试，常用方法包括以遗传基因突变为指标的试验（细菌回复突变试验和小鼠淋巴瘤细胞TK 基因突变试验）、以染色体畸变为观察终点的试验（微核试验和染色体畸变试验）和以DNA 损伤为观察终点的试验（单细胞凝胶电泳检测）［49］。 遗传毒理学是近几十年来随着分子生物学的发展才形成的现代毒理学分支学科，建立在遗传学、分子生物学、细胞生物学及分子毒理学等学科的基础上，直至21 世纪，国际社会也才将药物遗传毒理学的研究策略、实验方法逐渐标准化。我国20 世纪 70 年代末至80 年代初开始引起国外遗传毒性试验技术，开展技术推广与规范化，并初步应用于健康相关领域。至90 年代，我国开始建立遗传毒理学学科。因此，不难理解尽管古人记载了不同类型的中药毒性信息，但未曾记载遗传毒性，这与古人认识水平与检测技术的局限性有关。 近年有关中药遗传毒性的研究报道日益增加。半夏、细辛、板蓝根、杜仲茶、紫草、商陆、山慈菇、斑蝥、雄黄、吴茱萸次碱、昆明山海棠和柠檬苦素等中药或其制剂，遗传毒性试验一项或多项为阳性。例如，姜半夏汤剂在20 和30 g·kg-1 剂量下可导致小鼠胎肝微核率及DNA 受损率显著提高，具有一定的致突变作用［50］。细辛与板蓝根水煎液能明显诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形，具有致突变作用［51- 52］。采用Ames 试验、SOS/Umu 试验、DNA 交联试验、彗星试验和外周血网织红细胞微核试验等研究发现，杜仲茶可能具有致小鼠血淋巴细胞DNA 单链断裂作用［53］。采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠胚胎肝细胞转移微核试验，发现中药紫草水煎液［54］和商陆水煎液［55］具有剂量效应关系的遗传毒性。腹腔注射山慈姑提取物会导致小鼠精子畸变率升高［40］。雄黄对小鼠骨髓嗜多染红细胞有致突变作用，对CHL 细胞染色体具有致畸变作用［56］。吴茱萸次碱和柠檬苦素也表现致突变性［57］。昆明山海棠胶囊具有遗传毒性［46］。这些研究充分表明，应重视中药遗传毒性的研究，因为一旦作为新药上市，难以监控与防控。 笔者认为，现阶段应重视下列类型中药的遗传毒性研究：①含有干扰核酸代谢、细胞分裂和细胞周期等成分的复方中药。例如，马兜铃酸引起DNA加合物的形成，从而造成肝、肾细胞损伤，引起器官组织纤维化甚至肿瘤形成［15］。抗肿瘤中药中的细胞毒性成分具有损伤正常细胞DNA 的潜能。②某些含有重金属的复方中药。有学者采用彗星试验检测到朱砂对大小鼠染色体的损伤效应、导致遗传毒性［58］。③含有明显免疫抑制成份的复方中药。 由于免疫抑制后可能降低机体的免疫监视能力，对受损DNA 及突变细胞的清除能力减弱，从而导致遗传毒性的累积。④中药注射剂会因为缺少首过效应和胃肠道屏障，增加毒性成分与人体细胞DNA 相互作用的几率并发生突变的可能性。⑤适用于妊娠期或妊娠前期使用的中药。遗传毒性的组合试验中，有相当一部分是细胞或细菌的体外试验，如Ames 试验、细胞染色体畸变试验、TK 基因突变试验等。由于多数复方中药为成分复杂、不溶物多，加上渗透压、pH 和含有组氨酸等原因，使复方中药难以进行体外遗传毒性试验。但随着现代新技术、新方法的出现，上述体外试验已经具有良好的体内替代试验，能够评价相同的遗传终点。例如，经国际协调验证后的体内DNA 损伤试验（体内彗星试验）可以评价药物对脏器细胞DNA的损伤效应，而且还能够将药物吸收与代谢的因素考虑在内，与人体有更好的一致性。因此，完善的遗传毒性组合试验可以最大限度地排查复方中药潜在的遗传毒性，保障用药人群健康。 4.8 加强有毒中药的基础研究 有毒中药几千年的应用历史与其基础研究的薄弱不相符，而且一些有毒中药的毒性报道与基础研究首先多由国外发现，然后才引起国内关注。中药及其制剂产生毒性的原因多种多样，但有毒药材是复方中药产生毒性的重要原因之一。例如，洋地黄、万年青、八角枫、蟾酥和夹竹桃等含强心苷类的药材能够增强心肌收缩，减慢心率，具有潜在的心脏毒性；木通、黄药子和商陆等含皂苷的中药材可能抑制呼吸，导致心、肾损害［59］。此外，不同的中药品种，药效和副作用也大相径庭。例如，广防己和粉防己都属于防己，前者是马兜铃科，含有毒性成分马兜铃酸，而后者却是防己科，未有报道其含有马兜铃酸［60-61］。矿物药、重金属药及相关中药复方的毒性研究也需要丰富科学内涵，如砒霜、朱砂和牛黄解毒丸等［62-63］。因此，科学表征每一味中药的毒性是安全使用中药的重要依据。例如，美国及欧洲国家限制千里光及其相关制剂的使用，因其所含的吡咯里西啶类生物碱超出世界卫生组织限定的、可能导致肝毒性的含量［8］。当前，我国对有毒中药毒性分级沿用历代本草的经验进行分类，或者以LD50值的大小以判断其毒性等级，这些不仅缺乏科学、客观的实验数据依据，而且与实践情况存在出入。我们对多数有毒中药及其毒性成分的认识不足，对毒性成分的毒性效应更是远未认识，判断其允许使用的限量范围，需要科学、合理、充分的非临床或临床数据。因此，应当系统性加强有毒中药材毒性的基础研究以及GLP 条件下的非临床安全性研究，明确其毒性成分、毒性特点和毒性靶器官，明确量-效关系和量-毒关系，在基于安全性研究数据的基础上，建立有毒中药的毒性等级标准、质量控制标准。经过10~20 年的成果累积，逐步建立、健全常见有毒中药材的安全性数据库，这不仅仅对中药新药研发具有良好的指导意义，而且对于我国新药审评机构的审评具有重要的参考价值。 复方中药中的有毒中药材或毒性成分不代表其就具有毒性；反之，在非临床研究中，复方中药出现毒性也并非复方中单味药材或毒性成分效应的简单总和。复方制剂可以通过炮制减毒、配伍减毒，使复方中药的毒性效应消除或降低，从而避免对机体的毒性损害，这是复方中药的一大特点。配伍减毒在临床与中医理论中有较多的阐述与应用，但非临床的基础研究很少，尤其缺少GLP 条件下规范的基于毒性成分与体内暴露的实验研究、毒性成分之间相互作用的研究、毒性成分的拆方研究以及毒性成分的毒代动力学研究。因此，除了理论与临床实践外，应加强非临床研究，采用科学的实验数据求证中药的“配伍减毒”、“炮制减毒”。在现代科学与客观实验数据的基础上继承并发展控毒理论和技术，是有毒中药非临床研究的重要课题。有时人们对有毒中药材存在先入为主的不当认知。一些看似有剧毒的药材，在非临床动物试验中并未出现预期中的较强毒性；而一些长期使用、看似安全的中药，却存在较大的安全隐患。例如，川乌水提物对模型动物的生长发育无明显影响，对其造血系统无明显毒性，在高剂量下才具有肝、肾及心脏毒性［64］。笔者曾对某一含有不可口服大毒药材的复方中药进行过系统的非临床毒性试验研究。在犬连续灌胃3 个月的毒性试验中，除了胃肠道黏膜出现一些病变及异常神经症状外，未见其他明显毒性；犬心血管系统的安全药理学试验，也未见对心血管系统的影响。相反，以往认为毒性较低的中药材却发现较大毒性。例如，何首乌的肝毒性［65］；三七的肝肾毒性、神经毒性和细胞毒性［66］；葛根提取物可导致小鼠肝细胞坏死，升高谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，可导致体外体外培养的HepG2细胞及小鼠原代肝肝细胞受损，释放乳酸脱氢酶，这与其上调Mt1 基因及凋亡基因Bax 有关［67］。 5 中药非临床安全性研究的展望 中药作为中华民族的瑰宝传承至今，历经千百年临床实践，逐步完善、形成了独特的医疗体系。中药毒性也并非时至今日才发现。“神农尝百草”是对中药安全性的原始观察，是以人体经验判断为主，形成“神农尝百草，日遇七十毒”的传说。如今，中药学科日渐完善，形成了中药炮制、中药药理学和方剂学等分支学科。随着现代科学的飞速发展，中药毒性的研究技术与方法也长足进步，从最初简单的急性毒性试验、长期毒性试验发展到血清药理（毒理）学、毒代动力学、分子毒理学、影像毒理学和组学等领域，使人们更全面、清晰地认识中药的安全性。当前中药安全性研究仍存在诸多问题与难点亟待解决，应充分利用现代生命科学（由于是现代医学）技术方法，全面、系统地考察中药非临床安全性。值得提出的是系统生物学，它包括基因组、转录组、蛋白组、代谢组或脂质组，适合中药复杂成分、多靶点和多层次的研究。与传统毒理学方法相比，系统生物学技术可易于探索发现中药毒性作用机制、毒性通路和毒性靶器官，易于探索发现潜在的毒性生物标志物，甚至可以作为中药复方作用机制研究的补充和验证［67-69］。 对于中药安全性的研究与评价，应基于全面、科学、客观的研究数据，不能夸大中药毒性，也不能忽视规范、全面的非临床安全性研究。通过非临床动物试验获取全面的、科学的数据，做好中药毒性风险（效益）评估，趋利避害，有利于在临床试验期间实施必要监测方案，早期识别毒性、防控人体不良反应。只有探索建立符合中药特点的技术评价体系，科学地制定中药非临床安全性监管与审评策略，加强规范化中药安全性的研究与评价，才能促进中药的继承与创新发展，才能保障患者用药的安全有效。 参考文献 ［1］ Shi Q，Yu D. 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药审要点 ｜ 组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析 文章来源：中国新药杂志2016 年第25卷第6 期：634-638 组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析 余珊珊1，王海学1，胡晓敏1，林志2，邱云良3，王庆利1 (1 国家食品药品监督管理总局药品审评中心; 2 中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心; 3 国家上海新药安全评价研究中心) 摘要：单克隆抗体( mAb) 类药物是当今生物制药研发领域的热点，组织交叉反应( TCR) 试验作为单抗类药物临床前安全性评价的重要部分通常在Ⅰ期临床试验之前完成，可为临床毒性预测和监测提供重要线索。本文将结合单抗研发和审评案例，探讨并总结单抗类新药研发中 TCR试验的相关指导原则以及审评考虑。 关键词：单克隆抗体; 组织交叉反应; 生物药研发; 药品审评 单克隆抗体( mAb) 类药物通常具有特定的免疫特性，除与适应症相关特定靶部位抗原结合外，若人体正常组织中存在相同或相似的抗原决定簇，还会与靶器官外的组织或细胞结合从而产生严重的不良反应［1］ 。 组织交叉反应( tissue cross-reactivity，TCR) 试验是指在体外检测单抗或相关抗体样生物制品与组织上的抗原决定部位结合的试验，目的是确认受试抗体与药效靶组织抗原决定部位的结合，检测抗体是否与非靶部位组织抗原( 如组织交叉反应抗原) 结合，确定非临床安全性试验相关动物种属，以及预测毒性靶器官。相关动物种属是指表达与人相同的靶抗原并表现出相似的组织交叉反应特性的动物种属［2］。TCR试验通常采用免疫组织化学技术 ( im-munohistochemical，IHC) 对一系列人和动物的冰冻组织切片进行染色。近年来，随着新技术的发展，组织芯片、Western Blots、流式细胞( 对培养细胞或外周血样本) 等试验技术也开始应用于TCR 试验［3］。 单抗类药物近年来由于具有广泛的临床应用前景已成为生物制药研发领域的热点，TCR 试验作为评价单抗类药物临床前安全性的重要手段，为药物临床毒性预测和监测提供了重要参考信息，本文将结合案例概括并探讨单抗类新药研发中 TCR试验的相关技术要求和评价考虑。 1 关于 TCＲ 试验在新药研发评价中应用的相关技术指导原则 国际上已发布的涉及 TCＲ 试验的技术指导原则主要包括 FDA 的 PTC 指导原则( 4 个版本) 、ICH S6 以及 EMA 发布的相关指导原则，对 TCＲ 试验的科学和技术性进行了阐述。2003 年 3 月 20 日，我国发布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，有关组织交叉反应的内容在该指导原则的临床前研究部分［4］。 1. 1 PTC 指导原则的发展 1983 年，FDA 发布了最早涉及TCR 的指导原则，即 Points to Consider for the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use( 简称 PTC) 。随着工业界和监管机构对 TCＲ 认识的深入，该指导原则后来经历了 1987，1994，1997 3 个版本，不断深化对 TCＲ 试验目的、定义、组织材料、试验方法的认识。至1994 年，经过 3 版沿革的 PTC 指导原则指出TCR 试验的目的是发现和确定药物体内毒性试验相关动物种属; 受试物应与临床试验使用的受试物一致，且应在 I 期临床试验之前完成; 为覆盖人类基因的多态性，TCR 试验组织材料应为来源于至少 3 个无血缘关系的捐赠者的快速冷冻组织 ( 对于动物试验，来源于 2 只无关捐赠动物的组织材料即被接受) ，不再使用化学固定组织，首选手术来源的样本或经过良好保存的尸体来源组织，并在附录中列出了 32 个常用的人组织［5］; 试验技术要求方面，指导原则建议定量检测组织交叉反应并设置阴性和阳性对照，由于一般的组织细胞中均有转铁蛋白受体的表达，此以抗转铁蛋白受体抗体为阳性抗体，作为阳性对照中的“外部照”［5］; 建议根据抗体亲和力和预期血药峰浓度选择试验抗体浓度; 提出使用纯化抗原抑制试验区分潜在的非特异性交叉反应 ( 包括 FCR 介导的非特异性结合) 和由抗体互补决定区介导的特异性交叉反应。 试验方法方面，IHC、微量细胞毒性方法、免疫荧光抗体和 / 或自显影技术、集落形成试验( Cloning Forming Assay，主要用于检测血液和培养细胞的组织交叉反应) 、免疫细胞化学或其他合适的新方法都适用于TCR的检测。 1994 年版的 PTC 认为对于非结合单抗，若未检测到受试抗体与人组织的交叉反应性，且无表达相关抗原的动物和疾病模型，动物体内毒性试验建议仅需进行一般安全性试验; 无论有无与人组织的交叉反应或相同的靶抗原，单抗都应进行药动学和组织分布试验。该版指导原则提高了对有细胞毒性结合抗体的安全性关注。 1997 年第 4 版 PTC 指导原则问世［6］，首次提出TCR试验应检测多个抗体浓度，且最佳抗体浓度应为能与靶器官有效结合的最低浓度; 对于非结合单抗，若无与人组织的交叉反应，且无表达相关抗原的动物和疾病模型，可不进行动物体内毒性试验; 针对具有细胞毒性的结合抗体该版提出了更高的安全性试验的要求，明确指出若存在与人非靶组织的交叉反应性，通常应使用一种以上动物进行多剂量和重复给药的体内毒性试验。 1. 2 ICH S6 和 EMA 关于 TCR的指导原则 1997 年，ICH S6 与第 4 版 PTC 同年发布，在政策层面上强调 TCR 对于选择毒性试验相关动物种属的重要意义，同时明确了相关动物种属的定义—由于具有相关受体或抗原，受试单抗在其体内具有药理活性的动物种属。此外，ICH S6 指出，除 IHC 试验外，免疫化学或其他新技术皆适用于相关动物种属的选择; 当无表达靶抗原的相关动物种属时，若有动物表现出与人相似的非靶组织交叉反应，建议采用该种属动物进行体内毒性试验。然而，ICH S6 在 2011 年修订的附件( 第二部分) 注释中指出，动物组织的TCＲ 研究对选择相关动物种属的指导意义可能具有局限性。例如当候选药物不是好的 IHC 反应物时，TCＲ 试验从技术上可能是不可行的［7］。 2007 年，EMA 的“Guideline on Strategiesto Iden-tify and Mitigate risks for First-In-Human ClinicalTri-als with Investigational Medicinal Products”同样建议主要依据 TCＲ 试验结果选择体内毒性试验相关动物种属，并提出应结合靶部位抗原特性( 如表达、分布、一级结构) 和药效终点指标( 如结合占位、功能性后果 founctional consequence、细胞信号、药动学特性、代谢) 等因素综合分析TCR的试验结果［8］ 。 此外，EMA 颁布的 TCR待测组织与 FDA 的 PTC( 1997版) 内容略有不同，EMA 补充了腮腺、周围神经和扁桃体，去除了乳腺、结肠、眼球、输卵管、胎盘、前列腺、脊髓、输尿管和子宫［2］。 1. 3 我国关于 TCR的指导原则 我国相关指导原则对TCR试验在非临床试验中的定位和具体技术要求与国际主流认识基本一致，要求对具有细胞毒性的结合抗体要求进行更广泛的非临床安全性试验; 对于来源于肿瘤相关抗原的单抗，建议进行与各种人肿瘤组织的交叉反应性试验。 2 TCR 试验的发展现状和面临的问题 1997 年至今，TCR试验主要用于检测单抗类药物的潜在毒性和发现临床前试验的相关动物种属，其结果可能影响研发者对非临床安全性试验的决策。但是，业界对 TCR试验在多大程度上能够指导非临床安全性和临床试验仍存在争议。例如，有研究表明抗体与非靶器官的结合不一定预示相应部位的组织损伤，TCR试验结果与临床不良反应可能未必高度相关。利妥昔单抗临床上出现恶心、呕吐、轻度脱发和肝功能受损等不良反应［9］，但非临床安全性试验并未在胃肠道或肝脏组织上发现组织交叉反应。 Bussiere 等［10］针对多国多个制药企业的生物分子药物研发过程的回顾性研究数据显示，在 56 个单抗类药物研发案例中，只依据 TCR试验结果而准确预测临床不良反应的成功率仅为 2% ，73% 的研发案例未将 TCR试验结果作为指导相关动物种属选择的唯一依据。另外，由于某些抗原位点在体内无表达活性，抗体体外与非靶组织抗原位点的结合在体内可能不会实现，若仅依据 TCR试验结果推测毒性，可能造成对靶器官毒性的过度评价。 随着生物制药工程技术的发展，单克隆抗体已从原先的鼠源化逐步发展为人源化或纯人单抗，为 IHC 试验技术带来了新的挑战。首先，由于特异性的抗-鼠二级抗体较易识别鼠源一级抗体，不易受人和非人灵长类内源性或鼠 IgG 的干扰，IHC 技术检测鼠源单抗与靶抗原的结合相对容易。而随着单抗亲和力的提高和免疫原性的降低，一方面扩大了交叉反应组织的范围，导致非特异染色增多; 另一方面，人组织中高浓度的内源性自身抗体会干扰抗-人二级抗体识别相对低浓度的人源化或人抗体。对由基因工程技术改造天然结构得到的抗体样生物制品如 Fc-融合蛋白来说，商业购买到的抗-人二级抗体无法识别，这样的全新结构 造成单抗的标记技术难度增大［11］。 最后，国际上交叉反应试验用人体组织主要来自“组织银行”，该体系通常由学术性医学研究机构或CRO公司运作，而我国标准化TCR人体组织库尚在发展和完善的过程中，现阶段国内获取人体组织仍存在困难。 总体来看，目前组织交叉反应研究中存在诸多因素，例如试验用组织的质量和抗原保存情况、试验操作技术和病理学家的经验及专业判断等都会影响对试验结果的解释和准确判定。因此，推动和建立TCR试验用组织、试验体系、试验操作、结果判定以及试验总结报告的标准化，是确保研究数据客观、准确的有效手段。 3 TCR试验在单抗类药物非临床研究中的应用和审评考虑 在单抗类药物非临床研究阶段，TCR试验首先被用于相关动物种属的筛选，选择与人靶抗原表达强度和部位最相似的动物作为相关动物，再用选定的相关动物进行目标病变部位和正常组织的 TCR试验，预测可能的毒性，最终结合体内毒性试验暴露的毒性靶器官提示临床潜在的安全性风险。此外，尽管现有法规和指导原则尚未论证其科学性，TCR试验实际上还被用于可比性研究，评价生物类似药或生产工艺等变更前后产品生物学特性的相似性。 3. 1 TCR试验用组织材料和试验技术选择 TCR试验通常采用 IHC 技术对人和动物的冰冻组织切片进行染色。组织切片主要有新鲜组织和固定组织切片，相比于固定组织切片，新鲜组织冰冻切片上组织抗原未经过固定液处理，抗原保存最接近生理状态，是理论上首选的试验标本，也被最广泛的应用于国外的TCR 试验［2］。需要指出的是，相比于固定组织切片，新鲜冰冻切片的形态易受操作程序、保存条件和时间、切片温度等因素的影响，处理不当可能造成形态学改变，造成抗体定位靶抗原的困难。而且，有研究指出新鲜冰冻切片并非适用于所有靶抗原［12］。 目前我国人体新鲜组织获取仍有一定的困难。由于国外人体尸检率高，组织获取相对容易，而国内的标准化 TCR人体组织库尚未建立，仅有少数药企向国外购买新鲜组织，组织来源多为高加索人种，人种遗传背景与我国不同。大部分国内企业获得的人体新鲜组织的来源复杂，组织的保存、组织是否来源正常成人、组织结构的完整性缺乏必要的检查和验证，组织质量难以保证。因此，现阶段固定组织切片仍可用于我国 TCR试验，但更提倡以新鲜冰冻组织作为首选。 组织芯片技术目前也广泛运用于TCR试验，但组织芯片取样面积小，常不能涵盖器官完整的组织细胞结构，存在漏检等技术问题，一般建议用于研发早期 TCR试验前的高通量筛查［3］。在技术要求方面，建议芯片制作方提供组织来源的完整信息，如供体的一般情况( 包括性别、年龄、种族) 、临床病史、死亡原因、取样时间、处理办法、储存条件、保存时间等。 3. 2 TCR试验的非临床安全性研究案例 作者将结合研发案例探讨TCR试验的相关技术要求和评价考虑。 案例 1: 受试物为人白介素 6 受体 ( IL-6Ｒ) 单抗，与人和食蟹猴有相似的组织交叉反应，故选择食蟹猴作为相关动物种属。受试物与人肝细胞、子宫上皮细胞、神经胶质细胞的组织交叉反应未在食蟹猴组织中出现，食蟹猴体内毒性试验未提示肝脏毒性。但是，临床试验中观察到可逆的肝酶指标异常、总胆固醇升高等肝毒性反应。在该案例中动物组织交叉反应结果和毒性试验暴露的毒性靶器官与临床试验毒性靶器官不完全一致。分析认为人与动物在基因、药物组织分布等方面的差异会影响TCR试验对药物临床潜在毒性的预测，人组织交叉反应结果也仅能部分预测临床毒性反应，提示 TCR 试验的意义更多在于筛查。 案例 2: 受试物为可与在多种实体瘤中高表达抗原特异性结合的抗体药物偶联物 ( antibody drug conjugates，ADC) ，由于偶联的小分子药物可能具有潜在的心脏毒性，申请人首先用犬进行了体内心血管毒性研究，结果显示受试物和裸抗体给药后犬均出现了胃肠道毒性反应，对剖检取得的组织进行 IHC 检查发现受试物可与胃肠道上皮细胞特异性结合。申请人进一步对大鼠、犬、食蟹猴和人组织进行了TCR试验，发现受试物在人肠组织中表现出与抗原高表达犬相似的组织交叉反应性，而与食蟹猴、大鼠的相似性较差。临床 I 期试验随后观察到上消化道毒性反应，可能与受试物和消化道的非靶抗原结合有关。该案例依据TCR试验结果选择了合适的相关动物种属并成功预测了毒性靶器官以及临床试验的不良反应。 案例 3: 受试物为抗肿瘤 ADC 药物，申请人采用 IHC 方法检测了受试物和裸单抗与正常人体组织、食蟹猴组织、大鼠组织以及人肿瘤组织的交叉反应性，结果受试物和裸抗体均能与人和食蟹猴组织发生特异性结合，与大鼠组织无特异性结合，提示猴为相关动物种属; 与人肿瘤组织存在反应性，提示与药效靶部位的结合活性; 受试物与裸抗体的组织交叉反应组织基本一致，提示裸抗体由于失去共价结合而结合到非靶组织从而导致非预期毒性的风险较小。由于结合型抗体可能被降解而产生脱靶的安全性风险，申请人又针对受试物和免疫结合物中各组分( 如游离的细胞毒性小分子药物、裸抗体) 进行了猴体内毒性试验，结果发现受试物暴露的毒性靶组织与猴组织交叉反应提示的组织不一致，而与游离小分子药物的毒性反应基本一致，提示受试单抗的安全性风险可能主要来自降解的小分子药物。本案例中，TCR试验并未准确预测受试药物的毒性，但提示了受试物潜在毒性可能主要来源于脱靶小分子偶联物，提高了研发者对于小分子药物安全性风险的关注。该案例提示我们应根据毒性试验的整体结果来判断 TCR试验的相关性。 案例 4: 受试物亦为抗肿瘤 ADC 药物，靶抗原被认为存在于肿瘤组织和子宫。裸抗体与正常人组织有反应性，但与大鼠、食蟹猴无组织交叉反应，为确定相关动物种属，申请人又进行了犬、豚鼠、兔、仓鼠、食蟹猴、狨猴等的组织交叉反应试验，结果显示狨猴是唯一与人有相似反应的种属，于是进行了狨猴体内毒性试验并观察到严重的眼毒性，但人和狨猴组织交叉反应试验并未观察到受试物与眼的特异性结合。申请人于是追加了体外试验证实了靶抗原在眼的分布，更换免疫组化试验使用的抗体重新进行TCR试验，结果观察到了受试物和眼组织的结合，最终受试物由于严重的眼毒性未进入临床试验。该试验中组织交叉反应阳性组织与体内毒性试验暴露的毒性靶器官不一致，更换抗体后才显示出一致性，说明技术问题会影响TCR试验对毒性靶器官的准确预测。 案例 5: 受试物为抗 CD20 单克隆抗体，按利妥昔单抗生物类似药思路研发。申请人检测了受试物与人体组织、2 种 B 淋巴细胞瘤细胞株的组织交叉反应，结果受试物与人组织免疫反应阳性区域主要集中在 B 淋巴细胞聚集区，如脾小体、脾索以及淋巴结内生发区，体外 B 淋巴细胞瘤细胞株呈强阳性染色，提示受试物可与药效靶部位特异性结合。另外，作为生物类似药，建议进行比对的组织交叉反应试验，为两者体外生物活性相似性提供证据，为非临床一致性的判断增加证据权重，研发和审评将依据其一致性结果来决定后续临床试验的简化程度。 3. 3 评价思路和审评考虑 以上案例中TCR 试验结果的相关性各不相同，有时 TCＲ 结果与相关动物体内毒性和临床不良反应具有相关性，成功的预测了临床安全性风险，系最理想的情况。但实践中由于受到人与动物种属差异、试验技术制约等因素的影响，TCR试验结果可能与相关动物种属体内毒性和临床不良反应不相关。当结果无相关性时，应参考对相关抗原在动物和人体内表达分布特性等情况的认识，通过对毒性试验结果的整体评价，谨慎分析潜在的安全性风险，TCR试验仍可能具有积极的指导意义。例如案例 3，虽然TCR结果与受试 ADC 药物体内毒性反应不相关，但通过对试验结果的整体分析，仍然提示了 ADC 药物中小分子偶联药物脱靶相关的安全性风险。在案例 4 中，由于测定技术的局限造成了TCR试验的不相关结果，当重新建立试验方法后，TCR试验最终成功提示了受试药物的非靶器官毒性，顺利指导了研发进程，提示我们发展、改进以及使用新试验方法对TCR具有重要意义。总的来说，在运用TCR试验结果指导单抗研发时应遵循个案化原则，应结合整体药理学和安全性试验结果来评估TCR试验结果的相关性［2］。 正如前文所述，TCR试验甚至体内毒性试验并不能完全预测药物临床试验的毒性，可这并不妨碍TCR试验在当今单抗类药物非临床研发过程中发挥重要作用，因为尽管人用单克隆抗体一般具有较好的安全性和耐受性，但仍存在抗体与非靶组织抗原结合而导致的安全性风险，尤其当不能获得相关抗原动物模型时，组织交叉反应性检测可以预测临床试验潜在的安全性风险和提示临床试验中采用更保守剂量方案的必要性，具有重要的风险提示作用。 参考文献 ［1］王军志.生物技术药物研究开发和质量控制［M］. 北京: 北京科学出版社， 2007: 363． ［2］LEACH MW，HALPEＲN WG，JOHNSON CW，et al． Use of tissue cross-reactivity studies in the development of antibody-based biopharmaceuticals: history， experience， methodology，and future directions［J］． Toxicol Pathol，2010，38( 7) : 1138 －1166． ［3］林志，屈哲，吕建军，等． 单克隆抗体类药物组织交叉反应常见问题的探讨［J］.中国新药杂志，2012，21 ( 14 ) : 1600 －1606． ［4］CFDA．人用单克隆抗体质量控制技术指导原则［EB /OL］． ( 2003-03-20) ［2015 -11-21］. http: / /www.Cde. 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药审要点 | 中药新药药学研究的思考 文章来源：中草药 2019年12月 第50卷 第23期 中药新药药学研究的思考 赵 巍 1，马秀璟 1，屠鹏飞 2 1. 国家药品监督管理局 药品审评中心 2.北京大学药学院， 摘 要：为加快药品审评审批速度，国家药品监督管理局颁布一系列鼓励药品创新的政策，申请临床试验实行60日默示许可、建立沟通交流机制等制度。通过分析调整后的中药新药审评思路，充分认识药学阶段性研究的必要性，对中药注册申报不同阶段药学研究的侧重点从药材来源、工艺设计、质量标准建立等方面进行阐述，从而加快中药审评审批进程，为中药新药注册申报提供参考。 安全、有效、质量可控是药品的基本属性，也是药物研究和评价的核心内容。药品研发是一项综合了药学、药效、毒理、临床、统计等多学科的系统工程，周期长、投入高、风险大。药品研发又是一个渐进的探索研究过程，具有不确定性。上市前各阶段的药学研究内容是为下一步研究提供依据。中药的最大特点是来源于临床实践，在尊重临床用药经验的基础上进行系统的研究。药学研究是中药产业化质量稳定可控的基础，也是药品安全、有效的保障。目前中药药学研究的指导原则或技术要求虽然覆盖了原料、工艺、制剂、稳定性、变更等全过程研究，但是未体现阶段性要求的内容。本文通过对中药注册申报中不同阶段药学研究侧重的阐述，旨在为研发者提供借鉴参考，以期达到提高研发效率，降低研发风险的目的。 1 药学研究阶段性的提出背景 为提高药品创新研发能力，加快药品上市审评审批，国务院发布《国务院关于改革药品医疗器械审评审批制度的意见》（国发〔2015〕44号）[1]、中共中央办公厅国务院办公厅印发《关于深化审评审批制度改革鼓励药品医疗器械创新的意见》（厅字〔2017〕42号）[2]，提出“突出药物临床价值为导向”的审评审批思路。原国家食品药品监督管理总局发布《关于药品注册审评审批若干政策的公告》（2015年第230号）[3]，明确“对新药的临床试验申请，实行一次性批准，不再采取分期申报、分期审评审批的方式；审评时重点审查临床试验方案的科学性和对安全性风险的控制，保障受试者的安全。”国家药品监督管理局相继发布《关于调整药物临床试验审评审批程序的公告》（2018年第50号）[4]、《药品研发与技术审评沟通交流办法》（2018年第74号）[5]等文件，明确申请药物临床试验实行60日默示许可，在关键节点与申请人进行沟通交流等改革措施，鼓励药品创新，加快药品审评审批。 据此，虽然新药注册申请调整了技术审评理念，优化了审评程序，但是药学研究作为药品质量安全有效可控的保障，基础研究工作的内容是不变的。在尊重药品研发规律的基础上，研发者应树立质量源于设计的理念，关注原料源头控制和生产过程控制，以保证上市药品与经过临床试验验证的药品质量的一致性[6]。根据现行药品注册管理办法，新药注册申报分为申请临床试验和申请生产2个阶段，从研发的关键节点并结合注册申报可细分为临床试验前、临床试验期间、上市申请和上市后研究等不同阶段，各阶段的主要研究内容应有所侧重。 2 中药新药药学研究的主要内容 中药新药的药学研究主要包括药材来源与质量控制、生产工艺研究与工艺验证、质量研究及质量标准制订、药物稳定性研究、直接接触药品的包装材料和容器的选择等内容。新药批准上市后，随着规模扩大和科学技术的发展，其原辅料来源与保障、生产技术与设备改进、质量控制与标准提升、包装材料改进与稳定性改善等药学研究工作，仍将伴随着药品的整个生命周期。 中药的药学研究应依据中药特点，重视源头控制和过程控制，对影响中药质量的关键环节和控制方法进行研究，根据中药的自身特点和生产过程的量质传递研究，建立有效的质量控制体系，从而保障中药质量的稳定可控。这些内容既贯穿于整个新药研发过程，又在不同的研究阶段各有侧重。临床试验前研究和评价的重点围绕对临床试验样品的安全性进行相应研究，保证临床试验用样品的质量安全可控；临床试验期间药学研究继续完善提高；上市申请前研究和评价关注完善后的生产工艺须满足规模化生产的可行性，与经过临床安全有效试验验证的药品质量一致，保证质量稳定可控；上市后根据生产实际和质量控制要求进一步研究完善。 3 各阶段药学研究的重点内容 3.1 临床试验前阶段 中药新药临床试验前的研究包括合理设计药品处方、剂型、制备工艺、药效学、毒理学等一系列研究工作。药学研究主要目的是为I、II期临床试验研究提供质量稳定可控的样品，满足临床试验的需求，同时中试规模生产的样品用于非临床试验安全性、有效性的研究及评价。所以，此阶段药品处方、给药途径必须固定；药材基原应准确；饮片炮制工艺基本固定；制剂成型前的工艺基本固定；质量研究及质量标准关注安全性相关的质控研究，以保障药品质量基本可控。 3.1.1 处方原料 中药新药的原料包括药材、饮片、提取物。此阶段关注药材基原的准确，饮片炮制方法基本明确。对于使用野生中药材，须关注对保护物种的相关法规要求，关注中药材资源的可持续利用情况。建立原料的初步质量控制方法，如果处方原料未收入法定标准，需要完成相关的研究并建立相应的质量标准。关注原料质量的安全性研究及评价，应按照质量标准检验合格后投料。需要粉碎投料的饮片，应开展粉碎方法研究；以原粉入药的饮片，需开展灭菌方法研究并加以明确。对于辐照灭菌，应考虑使用该方法的必要性，在此基础上进一步研究，保证使用该方法的合理性。 3.1.2 工艺 在实验室小量试制阶段，通过批量试制对设计的工艺路线和方法进行改进和完善，制定出适合中试生产的工艺路线和初步工艺参数。最佳工艺路线应紧紧围绕影响生产的关键性问题进行研究，综合考虑生产周期、产率、设备条件以及原材料供应等方面因素。制剂成型前的物料制备工艺，包括提取、分离、纯化、浓缩、干燥工艺等，对可能影响物质基础的工艺方法和步骤基本固定，如提取方法和次数、溶媒种类等，并制定有效的控制和评价方法，如以相对密度控制浸膏的浓缩程度，以有效成分的转移率和含量、浸膏得率控制有效成分纯化的程度。各项工艺参数，包括温度、时间、压力等，在物质基础明确的基础上根据设备条件可做适当调整。成型工艺在制剂原料性质明确的基础上进行制剂处方设计和成型工艺研究，基本确定辅料种类和用量，以及成型工艺方法和工艺参数。 在中间试生产阶段，选择与中试规模配套的生产设备考核小试研究提供的工艺路线，进一步考察和完善工艺路线，相对固定工艺条件，确定主要工艺参数，对每一工艺步骤取得基本稳定的数据，对制备的中间体、半成品和成品进行质量研究，为后期向大生产的过渡提供依据。建议中试研究不局限于10倍处方量的3批次样品，应考虑到生产实际的药材质量波动因素，以及后期设备规模扩大等因素对药品物质基础的影响，以便积累数据完善研究。如提取挥发油、包合工艺、树脂柱纯化工艺等受规模影响较大的工艺，应充分研究关键质量属性，以设计合理的工艺参数保证物质基础的一致性。关注各条工艺路线提取率的变化范围，使浸膏量等在合理范围内波动。 3.1.3 质量研究及质量标准 质量研究应围绕药品的安全性、有效性开展，根据药品的特性、制剂特点以及关键质量属性建立初步的质量标准，检验方法应科学、合理、可行。用于制定质量标准的样品应为中试规模生产的样品。对于易混淆药材，建议建立专属性鉴别方法以保障药材基原的准确。在此阶段，原料和制剂需关注安全性研究以及对毒性药材的研究，开展外源性污染物和内源性毒性物质研究。对重金属及有害元素、农药残留、真菌毒素、生产过程中接触的有机溶剂残留及内源性有毒、有害成分的研究，视情况列入质量标准。在安全、有效的研究及评价基础上，质控指标的选取需要考虑整体性，对不同的工艺路线选取代表性指标进行定量控制研究，如提取挥发油的工艺控制。 3.1.4 稳定性试验 初步稳定性试验需关注是否有足够研究数据支持药品的有效期和贮存条件能够覆盖I期和II期临床试验的周期，确保药品质量基本可控和稳定，满足临床试验的需求。 3.2 临床研究阶段 临床研究期间药学初步研究中制剂处方、剂型、规格、工艺及其参数、质控指标等均有可能发生变化，必要时参照《已上市中药变更研究技术相关指导原则》进行相应研究。III期临床试验用样品的制备工艺应为生产规模，为后期申请的供生产检查用工艺资料提供依据，从而保证上市后药品质量与经过临床验证安全有效的药品质量一致。 3.2.1 I、II期临床试验期间 I期和II期临床试验期间，根据临床试验结果，制剂处方、剂型、规格可根据需要进行合理变更，以满足疗效和临床用药需求。需要注意的是，如果在此阶段改变给药途径，相应药效学和毒理学也要进行相关研究。如果辅料、工艺（含剂型）等发生了较大变化，应进行相关的工艺放大研究和稳定性试验研究，可对药品质量标准进行进一步的提升与完善，更好地控制药品质量，保障药品质量的一致性。继续开展长期稳定性试验研究，为III期临床试验和药品有效期的制定提供依据。 3.2.2 III期临床试验前 III期临床试验前，在前期基础上确定药材产地、最适采收年限、采收时节及炮制关键工艺参数，对于使用野生中药材，可考虑资源解决方案和引种栽培（养殖）的研究。应确定药物的制剂处方、剂型、规格，在符合GMP条件下进行临床试验用样品的放大生产，确定生产工艺及主要工艺参数，以保证III期临床用药品与上市后规模化生产药品的质量一致性。在此阶段确定的质量标准，需要注意的是不能简单地将对药材的质量控制指标硬搬至中间体或成品中，而是应该根据工艺特点等有针对性的设置质控指标，构建药材、中间体、制剂的整体质量标准体系。生产规模放大后的临床试验用样品应再进行稳定性考察，根据制剂特点并考虑上市后的实际环境条件进行研究，评价药品的稳定性以确定药品的有效期和贮藏条件。 3.3 上市申请阶段 申报生产的研究和评价重点首先是临床试验前生产工艺、III期临床试验用样品的制备工艺、大生产工艺3者的一致性及合规性，其次是大生产工艺的可行性及质量可控性，以保证生产出与临床试验用样品质量一致的药品，即上市药品的质量与经过临床试验已证明安全有效的药品质量保持一致，并保持批间质量稳定[7]。 3.3.1 处方 明确原辅料的来源及标准。在前期基础上确定药材的产地初加工、储运养护等条件。使用野生中药材的应说明中药材资源的可持续利用情况，开展种植（养殖）技术研究。需要注意的是，药材的产地应结合临床试验的实际确定。固定饮片的炮制工艺及工艺参数。 3.3.2 工艺 通过完成多批次的工艺放大验证，固定生产工艺，明确工艺路线及工艺参数，保证生产工艺能够满足上市后大生产的实际。生产工艺应与III期临床试验用样品的制备工艺一致，确保上市后药品与经过临床试验验证的药品质量一致，考察并明确中间体的存放条件。 3.3.3 质量研究及质量标准 质量标准的制定基于生产规模样品，有效反映药品质量。确定原料、中间体、制剂的质量标准体系，对于限度（幅度）的设置，结合临床试验样品的实测结果以及研究积累的实测数据，综合考虑药材质量波动、生产规模等影响因素，在符合生产实际的基础上合理拟定，保证药品质量稳定可控。同时应说明标准物质的来源及纯度，必要时需要完成结构确证及纯度分析等研究。 3.3.4 稳定性试验及直接接触药品的包装材料 明确拟上市的直接接触药品的包装材料和容器，说明其来源及标准。根据临床试验样品的稳定性研究结果，确定药品有效期和贮藏条件。 3.3.5 说明书、包装、标签 明确说明书、包装、标签中药学方面“性状、规格、贮藏、包装、有效期”项的内容。 3.4 上市后阶段 药品批准上市后，应保障药材来源的质量稳定性和可追溯性，建立药材种植（养殖）、饮片炮制、制剂生产的全过程质量控制体系，以确保药品安全、有效、质量稳定可控。同时，通过生产规模的放大和工艺成熟稳定的过程，累计多批样品实测数据，结合上市后的药品临床使用情况，对药品质量标准进行适当调整与修订，使其质控项目和限度更合理，并继续进行上市样品的稳定性及影响因素考察研究。由于多种原因，制剂处方、规格、工艺等方面会相应的变更，具体要求参照《已上市中药变更研究技术相关指导原则》开展研究。 4 结语 本文通过对中药注册申报不同阶段药学研究侧重点的思考，以期为研发者提供参考和借鉴。重视从实验室过渡到工业生产的关键环节。由于申请临床试验的生产工艺批准后可能会出现临床试验用样品的制备工艺及工艺参数发生较大变化，导致物质基础改变或明显改变，依据《中药注册管理补充规定》（国食药监〔2008〕3号）相关要求[8]，若调整后对有效性、安全性可能有影响的，应提出补充申请。临床试验用样品的制备工艺及质量是确定现场检查用生产工艺资料内容的依据，特别是III期临床试验用样品应为大生产规模，是评价工艺可行性的重点。中药药学阶段性研究是基于药品研发的一般规律，结合中药的特点进行实施，希望研发者利用好沟通交流机制，可在各阶段就研究问题与审评机构开展沟通交流，探讨关键技术问题以满足下一步研究工作的需要，可以避免不必要的浪费，重视III期临床试验前的药学沟通交流，降低研发风险、提高研发效率、加快新药上市。

药审要点 ｜ 直接抗丙肝病毒新药中的生殖毒性研究评价 文章来源：CDE官网“电子刊物”：20170103 直接抗丙肝病毒新药中的生殖毒性研究评价 笪红远 国家食品药品监督管理总局 药品审评中心 【摘要】随着对丙肝病毒（HCV）的研究深入，慢性丙型肝炎（CHC）治疗领域逐渐成为关注焦点之一。本文通过整理和分析国外治疗CHC的直接抗病毒治疗药物（DAA）公开的药品信息，将生殖毒性试验信息进行汇总，以期丰富对DAA药物生殖毒性的了解。 【关键词】慢性丙型病毒性肝炎；生殖毒性试验；抗病毒治疗；药物研发新药上市申请所需提供的非临床安全性试验数据资料通常包括安全药理学试验、单次给药毒性试验、重复给药毒性试验、遗传毒性试验、生殖毒性试验等[1]。非口服途径给药的药物需进行特殊安全性试验，复方制剂还需进行各成份相互影响的安全性试验；因存在致癌性担忧原因或临床上拟长期应用的药物还需进行致癌性试验；根据具体情况还应进行其他特殊非临床安全性试验，以进一步评估光毒性、免疫毒性、幼年动物毒性或依赖性等。其中，生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）作为药物非临床安全性评价的一部分，与单次给药毒性、重复给药毒性、遗传毒性等研究有着密切的联系，是评估药物开展临床研究风险和上市后安全性的重要内容。药物研发过程中应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症和适用人群特点、临床用药方案等，进行合理的试验设计，开展生殖毒性试验研究，以支持临床方案设计，降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险。 一、生殖毒性试验的一般考虑 目前，我国现有药物研发技术指导原则体系基本涵盖了非临床安全性研究的各方面，为新药研究与评价提供了重要的参考依据。从上世纪的《新药审批办法》开始，对新药进行生殖毒性研究就有明确要求。现行的《药品注册管理办法》中规定，对用于育龄人群的药物，应当根据其适应症和作用特点等因素对生殖毒性风险进行评价，必要时提供生殖毒性研究资料；2006年11月国家局药品审评中心发布的《药物生殖毒性研究技术指导原则》中详细阐述了关于生殖毒性研究的总体考虑，试验内容，结果分析与评价，及阶段性要求等；2005年12月《预防用生物制品临床前安全性评价技术审评一般原则》、2006年11月《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》和2007年1月《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》中分别阐述了相关产品生殖毒性试验的要求；2016年8月1日“关于在新药非临床研究评价中参考使用ICH M3指导原则的专家共识意见”中，明确了生殖毒性的阶段性数据要求，对申请临床试验和上市申请新药的生殖毒性的阶段性数据要求达成共识，与ICH M3中内容的基本保持一致 [2]，2016年8月5日在CDE网站发布了通知公告。生殖毒性试验是新药非临床安全性评价的重要内容，其目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。其在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用[3，4]。目前国际上已发布的生殖毒性研究与评价相关的指导原则包括但不限于：ICH S5 -药品的生殖毒性和雄性生育力毒性检测的指导原则；ICH S6 -生物技术药物的非临床安全性评价；ICH S9 -抗肿瘤药物的非临床评价；FDA -用于传染性疾病的预防性疫苗生殖毒性试验的考虑；FDA -生殖与发育毒性-研究结果综合评价相关性指导原则；FDA -睾丸毒性：药物研发期间的评估行业指导原则；FDA -妊娠妇女药代动力学研究指导原则；FDA -妊娠妇女药物暴露风险评估指导原则；FDA -以哺乳期妇女为受试人群的临床研究指导原则；EMA -生殖毒性的风险评估；WHO -疫苗非临床评价指南。这些指导原则对在我国开展生殖毒性研究有很好的指导意义和参考价值。ICH M3《支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》对支持新药临床试验和上市申请所需的非临床安全性研究进行了阶段性要求[1]，其中阐述了针对用药人群，应在适当的时候进行生殖毒性试验。由于临床开发中的分期愈来愈模糊，何时开展生殖毒性试验及开展何种生殖毒性试验需结合受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症、使用人群等因素进行综合评估[5，6，7]。例如：（1）某些特殊类型的化合物（如干扰素，其唯一相关动物种属为非人灵长类动物）的潜在生殖毒性可能已有大量的文献资料。如果一个相关新化合物的机理研究提示其很可能引起相似作用时，则可能没有必要进行系统的生殖毒性试验，提供评价其潜在生殖毒性的科学依据。（2）拟用于儿童的疫苗一般不用进行生殖毒性试验。拟用于妊娠妇女的疫苗必须进行生殖毒性试验。除非有证据显示疫苗在临床上不存在生殖毒性方面的担忧，拟用于可能妊娠妇女的疫苗应考虑进行生殖毒性试验。由于疫苗诱导的免疫应答主要可能影响胚胎或新生儿的发育，因此其生殖毒性试验研究一般仅考察疫苗对动物胚胎和幼仔发育的影响。（3）一些特殊情况下需提供相关的生殖毒性研究资料，如用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍、促精子生成药以及致突变试验阳性或有细胞毒作用等的新药）；另外一些情况下，如用于艾滋病的药物等，可适当延迟提交相关生殖毒性研究资料的时间。（4）抗肿瘤药物在提交上市申请时需要提供胚胎-胎儿毒性研究资料；一般毒性研究中以快速分裂细胞为靶标的药物或者已经鉴定为可导致发育毒性的药物不需提供胚胎-胎儿毒性研究资料；支持晚期或进展期癌症患者的治疗，通常不需要进行生殖毒性研究；细胞毒类抗肿瘤药物，由于作用机制决定了其很可能具有生殖毒性，鉴于其主要用于晚期肿瘤病人，因此可不进行生殖毒性试验。 二、上市DAA药物的生殖毒性情况 目前DAA药物研发热点主要集中在非结构蛋白3/4A（NS3/4A）酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂及NS5A抑制剂等[8，9]。自2011年美国FDA批准第一个NS3/4A蛋白酶抑制剂之后的5年中，相继批准了5个单药、5个复方药等共10个新药用于丙肝治疗[10]。我国目前已多个产品批准进入临床试验，但尚未有新药上市。根据药物研究评价的一般原则，作为新药申请上市时视具体情况需要对药物的生殖毒性进行评估。干扰素（IFN）联合利巴韦林（RBV）用药曾作为国际上各大指南推荐的慢性丙型肝炎的标准疗法[11，12]。已获准上市DAA药物中仍有部分需要与干扰素和利巴韦林进行联合用药，临床使用时不仅需要关注利巴韦林和干扰素不良反应中对生殖毒性方面的影响，而且需要关注DAA药物本身引起的生殖和发育方面的影响，及联合用药情况下对生殖毒性方面的影响。值得注意的是，利巴韦林可诱导可逆性睾丸毒性，具有较强的致畸作用，引起胎仔的先天缺陷和/或死亡；而聚乙二醇干扰素α可能减弱女性的生育力。本文将FDA批准上市不同靶点DAA药物的生殖毒性试验信息进行汇总： 1、以NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点的单方DAA药物 FDA现已批准的DAA药物中，以NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点药物共有三个[10]，分别于2011年5月、2011年5月、2013年11月上市，依次为默克公司的Victrelis、VERTEX PHARMS公司的Incivek、和强生公司的Olysio。无论适用于何种HCV基因型人群，这三个药物的共同点是目前仍需与聚乙二醇干扰素和RBV联合治疗。 （1）Victrelis（活性成分：boceprevir） Victrelis≥50mg/kg剂量在大鼠中可观察到睾丸毒性，该剂量下的暴露量低于临床拟用剂量（800mg TID）的暴露量，而在15mg/kg剂量时未观察到此反应。给药3个月恢复2个月的试验中，睾丸毒性可见恢复。而在小鼠或食蟹猴3个月给药试验中，剂量分别达900或1000mg/kg情况下，未发现睾丸毒性的出现，而这些剂量下Victrelis的AUC暴露分别约7和4倍的临床拟用剂量（800mg TID）。临床期间抑制素B和精液的有限分析未见任何明显的不良反应。因此，与减少的生育力相关的睾丸毒性的发现，可能仅限于大鼠。大鼠中睾丸毒性很可能在连续给药的首次给药后出现，与血清激素水平（LH，FSH，睾酮）的变化无关而是因附睾、前列腺和睾丸的重量过低所致。附睾中可见管腔细胞碎片和/或精子减少，而在睾丸中可见Sertoli细胞空泡化、精母细胞和精子细胞消耗和/或变性、生精小管萎缩。对生殖细胞成熟影响的可能性是否与受试物直接相关虽然不能完全排除，但是Sertoli细胞似乎是毒性的主要靶标。在雌性大鼠中，生育力和早期胚胎发育发现的可逆的不良反应剂量是在Victrelis剂量≥150mg/kg时，与血清激素水平（LH，FSH，孕酮和雌二醇）的变化无关。在75mg/kg剂量下（相当于人AUC暴露的1.4倍）未观察到这些变化，该剂量的AUC相当于人用剂量800mg暴露（每天3次）的1.3倍。Victrelis在大鼠和兔中剂量分别达600和300mg/kg情况下，分别相当于人用剂量暴露量的10倍和2倍，未观察到胚胎-胎儿发育或致畸性相关的不良反应，但在该剂量水平下可产生母体毒性。虽然代谢产物SCH 629144对发育中的胎儿的安全性尚未明确，但是由于在兔子中未检测到这种代谢物的存在，且其在大鼠中暴露非常低，所以当Victrelis与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合给药时，不认为该代谢物会引起临床上的安全问题。但如果Victrelis日后用于治疗HCV感染患者时不与干扰素和利巴韦林联合用药的话，该代谢产物在胎仔发育中的安全性必须明确。此外，在大鼠产前和出生后发育研究中，对怀孕，分娩和哺乳期相关的影响母体动物或对生长，活力，发育或繁殖性能的影响的第一代，或第二代的存活能力等方面未观察到受试物相关的影响，大鼠高剂量下的暴露量相当于临床拟用剂量的AUC暴露的6.5倍。新生儿/幼年大鼠中观察到的睾丸毒性，与成年大鼠一致。 （2）Incivek（活性成分：telaprevir） Telaprevir单用时对大鼠的生育参数有影响。对雄性大鼠生殖系统产生毒性的剂量仅在高剂量300mg/kg下，未观察到睾丸变性的NOAEL为100mg/kg，该剂量下的暴露量相当于人临床剂量暴露量的0.17倍。在大鼠生育力研究中，产生对精子的潜在影响（如活动精子百分比减少和非活动精子计数增加）的暴露量相当于人用剂量的0.30倍。此外，对生育力的影响还包括着床前丢失率、有死胎的孕鼠数及百分率的轻微增加。这些影响可能与雄性大鼠的睾丸毒性有关，但也不能完全排除对雌性大鼠的毒性。睾丸毒性在犬慢性毒性研究中未观察到。而且，接受telaprevir的受试者中检测的睾丸毒性相关的激素生物标志物（LH、FSH、抑制素B）水平与安慰剂组相当。所以认为睾丸毒性具有种属特异性。对小鼠或大鼠胚胎发育未见不良的药物相关性影响。由于在兔中无法获得充分的系统暴露，所以未进行药物对兔的胚胎-胎仔发育毒性研究。围产期/产后评价中药物相关的发现仅限于离乳前幼仔存活率和体重的减少或降低。此外，在犬给药9个月试验中，可见1只犬附睾有慢性活动性血管炎，此炎症在胃、心脏、卵巢、骨、骨髓等器官的组织病理学结果中均有发现。但总的来说，与这种效应相关的原发性和继发性病变通常是可逆的。药物诱导的血管炎与犬多动脉炎一致（Hayes等，1989）通常被认为具有可疑的人类相关性（Clemo等人，2003）。使用特拉匹韦的临床研究中没有报道血管炎，进一步支持这种病变的物种特异性。 （3）Olysio（活性成分：simeprevir） 在大鼠生育力研究中，Simeprevir相关的发现包括低剂量50mg/kg和高剂量500mg/kg下着床后丢失率增加；3只雄性大鼠（50mg/kg/day的2/24大鼠和500mg/kg/day的1/24大鼠）可见精子无活性，睾丸和附睾小，及导致与其交配的三分之二雌性大鼠未受孕。给药相关的睾丸和附睾的潜在毒性在大鼠和犬重复给药毒性试验中也有观察到，但由于发生率低和缺乏明确的剂量反应关系，还不清楚睾丸/附睾的不良发现是偶发的还是药物相关的。由于兔的生物利用度过低（2.5%），Simeprevir的胚胎-胎仔毒性在小鼠和大鼠中评价。在小鼠探索性胚胎-胎仔毒性试验中，1000mg/kg和2000mg/kg剂量下可产生致畸性（露脑和吐舌）。由于给药容量从10ml/kg降到5ml/kg，高剂量设定在1000mg/kg，因此探索性中出现的致畸性在正式试验中未见。申请人认为动物来源不同及试验系统不同可以解释正式试验中未见致畸毒性的原因。正式的小鼠胚胎-胎仔毒性试验中，高剂量1000mg/kg下可见药物相关毒性包括着床后丢失率增加，胎仔体重降低，骨骼变异率高。大鼠胚胎-胎仔毒性试验中未见生殖毒性。大鼠围产期试验，高剂量1000mg/kg下有两只动物分别在D10（给药4次）和D18（给药12次）死亡。与对照组（96.2%，n=22）相比，中（94%，n=23）、高（93%，n=22）剂量组动物着床率降低。离乳后母体动物体重和体重增长明显下降。F1代动物体重明显下降（高剂量下可达20%）和体重增长减慢（高剂量下可达40%）。此外，还可见中、高剂量（500、1000mg/kg）下F1代动物尾巴弯曲；子代雌性动物翻正反射延迟，性成熟晚，这可能与继发于母体毒性有关。高剂量下子代动物自主活动减少提示给药对体格发育的影响。总的来说，上述发现并未影响动物的生存，行为，交配或生殖能力。 2、以NS5B聚合酶抑制剂为靶点的单方DAA药物 以NS5B聚合酶抑制剂为靶点的单方DAA药物，目前仅有吉利德公司的Sovaldi（活性成分：sofosbuvir）于2013年12月获FDA批准上市[10]。适用于与IFN和RBV联用，或仅与RBV联用，治疗HCV患者（基因1、2、3、4型）及HCV和HIV-1合并感染者；每天口服1次，一次400mg，疗程12或24周。需要进行肝移植的肝癌患者临床用药需48周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Sofosbuvir未见对大鼠的胚胎-胎仔或对生育力有影响，在最高剂量下，主要循环代谢产物（GS-331007）在大鼠体内的暴露量相当于人临床剂量暴露的5倍。兔胚胎-胎仔毒性试验中未见对母体和胚胎-胎仔有任何明显影响，NOAEL为500mg/kg。大鼠围产期生殖毒性试验中，除药后1小时可见剂量相关的口周白色和/或红色物质外，未见明显的母体毒性及胚胎和子代发育的不良影响。 3、以NS5A抑制剂为靶点的单方DAA药物 以NS5A抑制剂为靶点的单方DAA药物，目前有施贵宝公司的Daklinza（活性成分：daclatasvir dihydrochloride）于2015年7月获FDA批准上市[10]。联合Sovaldi和RBV，或仅联合Sovaldi扩展至可治疗HCV 基因1或3型患者。Daclatasvir每天口服1次，每次60mg。本品与CYP3A强抑制剂联用，需降低剂量为每天1次口服给药，每次30mg；与CYP3A中度诱导剂联用，需提高剂量为每天1次口服给药，每次90mg。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：在任何测试剂量下，daclatasvir对雌性大鼠的生育力未见影响，在雌性大鼠体内这些剂量的暴露量相当于人临床剂量暴露的24倍。在雄性大鼠中，200mg/kg/day剂量下对生殖终点的影响包括前列腺/精囊腺重量减轻，畸形精子最小程度地增加，以及因此产生的着床前丢失率增加，该剂量下在雄性大鼠的暴露量相当于人临床剂量暴露的26倍。50mg/kg/day剂量下对雄性大鼠生育力未见明显影响，该剂量下的暴露相当于人临床剂量暴露的4.7倍。在大鼠和兔胚胎-胎仔毒性试验中，所有生殖毒性反应均是继发于母体毒性，分别相当于人临床剂量的6倍（大鼠）和22倍（兔）。大鼠发育毒性包括胎仔畸形，胚胎死亡率高，胎仔体重降低。兔发育毒性包括胚胎-胎仔死亡率增加，胎仔体重降低，胎仔肋骨畸形和变异增加，明显影响头和头盖骨的发育。因此，对大鼠和兔母体及胎仔的NOAEL分别为50mg/kg/day和40/20mg/kg/day。大鼠围产期毒性试验显示，引起母体毒性的100mg/kg剂量下可见死胎率增加和子代体重降低，对母体和发育毒性的NOAEL为50mg/kg/day。 4、复方DAA药物 FDA现已批准的DAA药物中，复方药物主要有三种组合，分别为以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂的组合；NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合；NS5A抑制剂，NS3/4A蛋白酶抑制剂的组合。其中，复方药物中的单方由已上市药物与未上市药物组成，或由多个未上市药物组成。除Viekira park（组合包装）和Viekira XR（缓释片剂）外，其他均为固定剂量复方。 （1）以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂组合的复方 以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂组合的两款复方，均为吉利徳公司的品种，分别为2014年10月获FDA批准上市的Harvoni[10]和2016年6月获FDA批准上市的EPCLUSA[10]。Harvoni（活性成分：ledipasvir/sofosbuvir），每天口服1次，一次90mg（ledipasvir）和400mg（sofosbuvir），初治未肝硬化或已肝硬化的患者及经治未肝硬化的丙肝患者，疗程为12周；经治已肝硬化的丙肝患者，疗程为24周。用于治疗基因1型丙肝感染患者，可单用，也可和其它口服制剂联合使用。2015年11月，扩展至可治疗HCV 基因1、4、5、6型患者。Epclusa（活性成分：velpatasvir /sofosbuvir），用于治疗HCV 全基因型（1、2、3、4、5、6型）患者，每天口服1次，一次100mg（velpatasvir）和400mg（sofosbuvir），无肝硬化或代偿性肝硬化的丙肝患者（Child-Pugh A级），疗程为12周；失代偿性肝硬化的丙肝患者（Child-Pugh B和C级），与利巴韦林联合治疗，疗程为12周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Ledipasvir对交配和生育力未见不良影响。在雌性大鼠中，100mg/kg剂量下可见黄体、着床数目及胚胎存活数目轻微减少，这与短暂的母体体重降低和食量减少有关，该剂量下暴露量相当于人临床剂量暴露的3倍。在未见影响的最高剂量下，Ledipasvir在雌雄动物中的暴露量分别相当于人临床剂量的2倍和5倍。大鼠胚胎-胎仔毒性试验中，由于100mg/kg剂量下可见母体体重增长和食量的降低，认为对母体的NOAEL为30mg/kg。未见药物相关的胚胎-胎仔存活、内脏或骨骼的异常，因此，认为对发育毒性的NOAEL为100mg/kg。兔胚胎-胎仔毒性试验中，未见明显母体毒性和对胚胎-胎仔的影响，NOAEL为180mg/kg。大鼠围产期试验未见明显母体毒性和生殖发育毒性。Velpatasvir对大鼠对生育力和胚胎-胎仔发育未见有影响，在测试的最高剂量下，velpatasvir暴露约为RHD中人类暴露的6倍。由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以胚胎-胎仔发育毒性在小鼠、大鼠和兔中均进行了评价。小鼠和大鼠中未见对母体或胚胎-胎仔发育有影响，NOEL分别为1000mg/kg和200mg/kg。兔胚胎-胎仔毒性试验中，300mg/kg剂量下可见动物死亡，尽管死亡原因不明，但还是可见瘦弱、少量/无粪便、被毛粗糙，体重降低和食量减少等表现，所以对母体毒性和胚胎-胎仔发育的NOEL分别为100mg/kg和300mg/kg。大鼠围产期试验中，剂量达200mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Sofosbuvir生殖毒性信息如2.2中所述。 （2）以NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合的复方 以NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合的两款复方，均为艾伯维公司的品种，分别为2014年12月获FDA批准上市的Viekira Pak [10]和2016年7月获FDA批准上市的Viekira XR[10]。Viekira Pak（活性成分：dasabuvir/ombitasvir/paritaprevir/ritonavir），Ombitasvir/paritaprevir/ritonavir每天早上口服1次，每次2片（12.5/75/50mg）；dasabuvir每天早晚各口服1次，一次250mg。本品单用或与RBV联用治疗HCV基因1型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，或是合并感染HIV患者，疗程为12或24周。Viekira XR（活性成分：Ombitasvir/ritonavir/dasabuvir/paritaprevir），Viekira XR药物中的活性成分与Viekira Park相同，不同的是Viekira XR为缓释片剂，每天1次，1次3片，需与食物一起服用。用于治疗HCV基因1b型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，每天伴服2次利巴韦林，疗程12周；与RBV联用治疗HCV基因1a型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，疗程12周或24周。HCV和HIV-1共感染者，用法用量参照上述用法；肝移植患者在肝功能正常伴有轻度纤维化（Metavir评分≤2）时，推荐与RBV联用24周。生殖毒性信息同Viekira Pak。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：由于Ombitasvir在大鼠体内未能获得充分暴露，所以采用小鼠进行发育毒性研究。Ombitasvir剂量达200mg/kg，对小鼠胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响， 该剂量下Ombitasvir在小鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的25倍。雄性动物生殖器官重量的药物相关性变化（前列腺和精囊腺重量增加、睾丸重量降低）不认为具有毒理学意义变化。Ombitasvir剂量达临床拟用剂量暴露的4倍时，兔未见有药物相关的母体毒性或致畸性。兔胎仔体内的药物暴露水平约为母体血浆药物水平的1-2%。小鼠围产期试验中，剂量达200mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Paritaprevir和ritonavir剂量分别达300mg/kg和30mg/kg，对大鼠的胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响，300mg/kg剂量下Paritaprevir在大鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的2-5倍。Paritaprevir和ritonavir在300/30 mg/kg剂量下，未见小鼠有母体毒性和胚胎-胎仔的致畸性。相同剂量下，大鼠未见有母体毒性，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Dasabuvir剂量达800mg/kg，对大鼠的胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响，该剂量下Dasabuvir在大鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的16倍。Dasabuvir剂量达400mg/kg，未见对兔有母体毒性或致畸性，该剂量下相当于临床拟用剂量下暴露的12倍。大鼠围产期试验中，剂量达800mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。 （3）以NS5A抑制剂和NS3/4A蛋白酶抑制剂组合的复方 以NS5A抑制剂和NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点的复方，目前有默沙东公司的Zepatier（活性成分：elbasvir/grazoprevir）于2016年1月获FDA批准上市[10]。餐前或餐后每天口服1片。本品单用或与RBV联用治疗慢性HCV基因1型或4型初治或经治患者，或合并感染HIV-1者，疗程为12或16周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Elbasvir对雌雄大鼠生育力的NOEL分别为1000mg/kg和300mg/kg。尽管1000mg/kg剂量下精子数目降低了15%，但是对睾丸重量、精子活动力和形态和雄性的生育力未见影响。由于Elbasvir在1000mg/kg剂量下可见体重增长轻微减慢，所以对大鼠的母体毒性和发育毒性的NOEL分别为300mg/kg和1000mg/kg。Elbasvir对兔母体毒性和发育毒性的NOEL是1000mg/kg。大鼠围产期试验中，除1000mg/kg剂量下可见母体短暂的体重增长减慢和食量减少外，未见对大鼠有母体毒性，对子代的行为、生殖和发育有影响。Grazoprevir在400mg/kg剂量下，对雌雄大鼠的生育力和胚胎-胎仔的发育未见明显影响。Grazoprevir在100mg/kg剂量下，对兔的胚胎-胎仔发育未见明显影响。大鼠围产期试验中，Grazoprevir剂量达1000mg/kg未见对大鼠有母体毒性，对子代的行为、生殖和发育有影响。 三、临床开发过程中生殖毒性阶段性要求 ICH M3《支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》对生殖毒性研究开展的阶段性明确如下：在重复给药毒性试验中对雄性生殖器官进行了详细检查（包括全面的组织病理学检查），雄性生育力试验完成前，I、II期临床试验可入组男性受试者。雄性生育力试验应在大规模或长期的临床试验开始前完成。在妊娠妇女进入临床试验前，各项生殖毒性试验和遗传毒性试验标准组合均应完成。如果在重复给药毒性试验中对雌性生殖器官进行详细检查，无生育可能妇女在缺少动物生殖毒性试验的情况下可进入临床试验。而对于有生育可能的妇女（WOCBP）：为使胚胎或胎儿风险降至最低，通常有两种可选方式：一是在I期临床试验前完成II段生殖毒性试验，在知情同意书中说明可能的风险。二是I期临床试验前不进行试验II段生殖毒性试验，要求临床试验过程中采取避孕措施以控制风险，但通常需要在III期前完成（视临床试验规模和时间）：①进行妊娠试验（如测定HCG β亚单位）、采用高效的避孕方法，并仅在确认月经期后进入试验。②进行受试者教育。③上述妊娠试验检测和受试者教育应涵盖整个药物暴露期间，并可能超过临床试验期间。④基于现有与生殖毒性相关的信息起草知情同意书，如与结构和/或药理作用相关的药物的生殖毒性信息等，说明未进行相关试验可能带来的风险；如无相关生殖毒性信息，应与受试者交流告知药物对胚胎或胎儿存在未知风险。在未完成动物生殖毒性试验入组WOCBP时，还需结合对药物作用机制的认识、药物类型、药物在胎儿暴露的程度等进行权衡。通常情况下，获得两种动物种属中的初步试验结果，并在临床试验中采取严格避孕措施后，WOCBP可入组小规模、短时间的临床试验（小于150人、不超过3个月）。如果超过上述规模和时间，需要完成正式试验。I段生殖毒性试验：在重复给药毒性试验对雌性生殖器官进行了评价的前提下，雌性生育力试验需要在大规模或长期的临床试验（如III期试验）前完成。III段生殖毒性试验：通常上市申请时提交。与临床试验中儿科用药人群的年龄和性别相关的生殖毒性试验对于提供直接毒性或发育风险的信息（如生育力和围产期发育试验）可能也是很重要的。对于支持男性或青春期前时期女性参与的临床试验，胚胎-胎仔发育毒性试验并不重要。 四、思考和建议 生殖毒性试验常规推荐使用大鼠或兔进行评价。如果选择其它种属动物进行试验应说明动物选择的合理性，比如因种属特异性，或因受药物全身暴露程度的限制，或因生殖毒性已比较肯定需明确生殖毒性物质特性的试验研究（而不是评估其危险性）。如由于兔的生物利用度过低，所以telaprevir和simeprevir（均为NS3/4A蛋白酶抑制剂）在胚胎-胎仔发育毒性试验中均选用了大鼠和小鼠来进行评价。而EPCLUSA（NS5B聚合酶抑制剂、NS5A蛋白酶抑制剂组成的复方）的一个组份velpatasvir由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以胚胎-胎仔发育毒性在小鼠、大鼠和兔中均进行了评价。Viekira Pak（NS5B聚合酶抑制剂、NS5A蛋白酶抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组成的复方），其中的组份Ombitasvir由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以采用小鼠进行了生育力、胚胎-胎仔发育、围产期毒性研究；组份Paritaprevir和ritonavir采用小鼠进行胚胎-胎仔发育毒性研究。现已获得的DAA药物非临床生殖和发育毒性信息显示：NS3/4A蛋白酶抑制剂在检测的一定剂量下可见对雄性生育力的影响；大鼠特异的睾丸毒性，雌性动物生育力的降低可能与睾丸变性有关；或在产生母体毒性剂量下可见对子代的发育毒性。临床期间抑制素B和精液的有限分析未见任何明显的不良反应。NS5A抑制剂在引起母体毒性剂量下可见有胚胎毒性，发育毒性。而NS5B聚合酶抑制剂未见明显生殖毒性。某些情况下，亲代和子代所表现出的生殖毒性可能是母体毒性所继发的，如雌性大鼠可见黄体、着床数目及胚胎存活数目轻微减少，或雄性大鼠前列腺和精囊腺重量增加、睾丸重量降低等。上述药物都可通过乳汁分泌。信息提示不同靶点的DAA药物在进行临床试验时关注点存在差异性，需要应结合毒性反应特点和安全范围设计合理的风险管控措施。对于根据非临床试验中发现（在预期的临床相关暴露水平下）认为可能对人体睾丸产生毒性的药物，在其临床研发早期阶段应制订可最大程度降低或监控人体睾丸损伤风险的计划[13，14]。如果将来有生育打算的男性将要暴露于药物，应在知情同意书中说明睾丸损伤的可能风险。临床试验期间，应在这些受试者中收集药物对睾丸影响的信息。如果认为精液参数的变化与激素紊乱有关，可考虑评估睾丸损伤的其他生物标记物（如睾酮血清浓度、促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）和抑制素B）。综合已有的DAA药物生殖毒性方面的信息来看，一是DAA药物在一定剂量下可能产生生殖毒性，主要是对雄性动物的损伤；二是与靶点相关，主要在NS3/4A靶点，尤其是一代产品，但由于适应症特殊，且目前丙肝治疗在某些情况下还需与利巴韦林和/或干扰素联合用药，所以对DAA药物的生殖毒性问题不影响药物进入临床；三是相关生殖毒性可以在临床通过生物标记物监测评估对人体的风险；四是动物种属选择应考虑药物暴露量可以充分评估毒性，为临床应用提供制订保障措施的建议。由于临床分期愈来愈模糊，从FDA批准的DAA药物的生殖毒性信息来看，何时开展生殖毒性试验及开展何种生殖毒性试验需结合受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症、使用人群等因素进行综合评估。生殖毒性结果相关的评价最终应落实到临床研究受试者范围的限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。在我国优先审评审批政策支持下[15，16]，目前国内已有多家企业的DAA药物进入临床II期/III期阶段，鼓励申请人应针对试验设计、提交时间等与监管部门加强沟通交流。 【参考文献】 [1] ICH M3(R2) Guidance on Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorisation for Pharmaceutical s [EB/OL ]; (2009-06-11)[2016-12-12]. http://119.90.25.32/www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Multidisciplinary/M3_R2/Step4/M3_R2_Guidline.pdf. [2]国家食品药品管理总局药审中心关于在新药非临床研究评价中参考使用ICH M3指导原则的专家共识意见， http://www.cdeapp.org.cn/office/officeWorkNews/show?codeWid=6181b5b046dc177f5be3e1e263121e6b&wtype=2. 2016.8.5通知公告. [3] SFDA. 药物生殖毒性研究技术指导原则. 2006年11月. [4] ICH S5(R2) Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products and Toxicity to Male Fertility; June 1993. [5] ICH S6(R1), Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals.(dated 12 June 2011). [6]ICH S9 Guideline: Nonclinical Evaluation for Anticancer Pharmaceuticals; November 2008. [7]CDE. 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则. 2006年11月. [8]新药咨询.全球抗丙肝药物市场纵观[J].临床药物治疗杂志, 2015年11月,第13卷第6期. [9] 于春荣, 笪红远, 王庆利. 慢性丙型肝炎治疗药物研发的挑战与思考[J]. 中国新药杂志. 2016,25(18): 2116-2120 [10]Drugs@FDA.http://www.accessdata.fda.gov.scripts.cder.Drugsatfda/index.cfm. [11]中华医学会肝病学分会，中华医学会传染病与寄生虫病学分会。中国丙型肝炎防治指南[R]（2014版）. [12]慢性丙型肝炎抗病毒治疗专家委员会.慢性丙型肝炎抗病毒治疗专家共识[J].中华实验和临床感染病杂志（电子版），2009,3(3):343-352. [13] FDA. 睾丸毒性：药物研发期间的评估行业指导原则. 2015年7月. [14] FDA. 生殖与发育毒性-研究结果综合评价相关性指导原则. 2011年9月. [15]国家食品药品监督管理总局关于药品注册审评审批若干政策的公告（2015年第230号），2015年11月11日颁布. [16]总局关于解决药品注册申请积压实行优先审评审批的意见.食药监药化管（2016）19号，2016年2月26日颁布.

药审要点 | 药物雄性生殖毒性评价考虑要点及FDA相关指导原则介绍 文章来源：中国新药志,2016,25(24):2766-2772. 药物雄性生殖毒性评价考虑要点及FDA相关指导原则介绍 Some important considerations on the evaluation of male reproductive toxicity for pharmaceuticals and introduction of FDA′S related guidances 张立将1 ，黄芳华2 ，王庆利2 ，郑高利1 (1 浙江省医学科学院安全性评价研究中心，2 国家食品药品监督管理总局药品审评中心) 摘要：雄性生殖毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容。本文首先介绍了美国食品药品监督管理局(FDA)2015年发布的药物雄性生殖毒性相关的2个指导原则。随后根据药品审评及安全性研究实践，并结合国内外指导原则中雄性生殖毒性相关内容，讨论目前对药物雄性生殖毒性评价的一些考虑要点。 关键词：雄性生殖毒性；药物；指导原则；考虑要点 生殖毒性研究是药物非临床安全性评价的重要内容，在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥了重要作用。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)自1992年起先后发布了生殖毒性研究相关指导原则，包括ICHS5A：Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products和S5B(M)：Maintenance of The ICH Guideline on Toxicity to Male Fertility，2005年将两者合并为s5(R2)：Detection of Toxicity to Reproduction for Medicinal Products＆ Toxicity to Male Fertility(药品生殖毒性及雄性生育力毒性检测)[1] 。2006年，我国借鉴了国外(如ICH，FDA，OECD等)相关指导原则的科学内涵，并结合实际国情，制定发布了我国的《药物生殖毒性研究技术指导原则》[2]。该指导原则的实施，大大促进了我国药物生殖毒性研究的规范化进程，提升了国内研究机构的研究水平，加快了与国际药物非临床研究要求的接轨。近年来，随着我国不孕不育率逐年提高、男性精液质量呈下降趋势吗，，药物的雄性生殖毒性应得到更多的重视。然而在传统的三段式药物生殖毒性研究中往往以雌性生殖和发育毒性评价为评价重点，而雄性生殖毒性仅是I段研究的一部分内容，往往未得到充分的关注与评价。 药物雄性生殖毒性，主要指药物对雄性生殖系统(睾丸、附睾等)及生殖功能造成损伤，一般包括生殖器官器质性改变、精子数量及质量下降、性行为改变、生育力降低、性激素分泌异常等[4] ，另外还有往往易被忽视的通过精子遗传物质传递，和／或精液-阴道摄入而产生的胚胎-胎仔发育毒性[5-6] 。 2015年，美国FDA发布了关于药物睾丸毒性和雄性介导发育毒性的2个指导原则(草案)[5-6] 。同年，ICH启动了对已实施10年的s5(R2)的修订工作，并发布了s5(R3)的制定工作计划[7-8] 。本文根据审评及研究过程中对雄性生殖毒性评价的实践，并结合FDA新指导原则以及ICH和我国指导原则中雄性生殖毒性内容，讨论目前对药物雄性生殖毒性研究相关问题的一些考虑要点。 1 FDA雄性生殖毒性相关指导原则简要介绍 1.1《雄性介导的药物发育毒性风险评估指导原则》 (Assessment of Male-Mediated Developmental Risk for Pharmaceuticals Guidance for Industry)[5] 该指导原则于2015年6月l1日发布草案。该指导原则草案总结了当前FDA对男性人群使用药物后潜在相关发育毒性风险评估的策略与方法。 1.1.1 雄性介导的药物发育毒性风险 雄性介导的药物发育毒性风险，指由雄性动物／男性人群给药而带来的子代发育毒性影响，主要包括：① 药物作用于精子细胞而产生的发育毒性风险。② 药物通过精液转移到妊娠女性体内(阴道摄入)而产生的孕体(胚胎-胎仔)发育毒性。 1.1.2 雄性介导发育毒性风险的评估考虑与建议 评估药物潜在的发育毒性应考虑的几项关键因素：① 药物及类似化合物的生殖和发育毒性。② 药物的细胞毒性或遗传毒性。③ 毒性风险的药理学作用特征(如该药物是否直接或间接影响发育信号通路、快速分裂细胞或内分泌功能)。④ 药物的药动学特征(ADME，如在雄性生殖器官中的分布、蓄积或在精液中分布)。基于上述考虑，FDA会综合分析申请人提供的资料以给出临床试验期间是否需要男性避孕的建议。FDA建议，除非有明确证据证明该药物仅影响精子细胞，否则避孕措施适用于有生殖能力的男性和输精管切除手术的男性，因为对于输精管切除男性，药物同样可以通过精液转移到女性体内。 根据上述信息，雄性介导发育毒性风险评估时将药物分为两大类：① 遗传毒性、生殖和／或发育毒性未知的药物。② 非临床研究已显示遗传毒性、生殖和／或发育毒性的药物。对于这两类药物，临床试验中男性研究对象都应该采取必要措施以避免怀孕和／或孕体的药物暴露，其中对于有明确发育毒性的药物，其避孕措施应一直实施直到雄性介导的影响被完全评估(如检测男性精液中药物浓度达到一定的限度以下)。指导原则中列举了2个这类发育毒性风险的例子：仅雄性给药的动物试验中，精液中存在沙利度胺可引起兔胎仔畸形等发育毒性，环磷酰胺可增加交配后孕鼠着床前丢失率；且有证据显示，沙利度胺在人精液中浓度与血浆中浓度呈相关性。 对于药物暴露后男性避孕周期，FDA一般建议为5倍药物半衰期+90d(1个生精周期+未射出精子的残留时间)。 1.1.3 评估药物的雄性介导发育毒性的非临床研究 用于评估药物引起的雄性介导发育毒性的非临床研究包括体外研究、体内研究以及相关的药动学研究。 体外研究：遗传毒性标准组合试验，各种体外精子药物作用试验(如杀精试验、精子遗传学完整性试验)和体外胚胎全培养等。 体内研究：进行生殖器官病理组织学检查和／或成熟雄性动物精子分析的一般毒性试验，生殖和发育毒性标准组合试验。对于大部分药物而言，评价父代介导的发育毒性仅有的标准体内试验为生育力与早期胚胎发育毒性试验，当仅雄性动物给药时可以进行直接的毒性评价。一旦发现明显的发育毒性影响(如着床前后死亡、早期胚胎畸形)，申请人应开展交配前单性别给药试验，以分析雄性和／或雌性动物单独给药对毒性影响的贡献作用。因常规的生育力与早期胚胎发育毒性试验不能发现全部的发育毒性指标，故若雄性单性别给药试验出现发育毒性信号时，应该考虑开展追加试验，使妊娠动物孕期延长至临产前再行解剖检查。 药动学研究：对于动物或人类潜在发育毒性药物，精液中药物含量的测定有助于定量推测可能到达孕体(胚胎／胎仔)中的暴露水平。孕体暴露水平可以通过以下假设模型进行推测(以小分子药物为例)：精液射出量为5 mL、精液中药物浓度=血浆最高药物浓度(Cmax)、100％ 的阴道摄入、雌性血容量为5000 mL，100％ 透过胎盘屏障。孕体暴露水平=Cmax ×5mL × 100％／5000mL ×100％ ，即基于最大可能算出的孕体暴露水平。若此暴露水平低于发育毒性NOAEL剂量10倍以上，可以不要求进一步的雄性介导发育毒性风险的评估；若暴露水平较高，应考虑风险控制策略(如避孕)。 1.2《药物研发过程中睾丸毒性评价指导原则》(Testicular Toxicity：EvaluationDuringDrug Development Guidance for Industry)[6] 该指导原则于2015年7月16日发布草案。该草案旨在为研发可能有潜在睾丸毒性的药物提供帮助，在基于非临床研究发现的基础上，对临床监测及临床试验设计提供指导。下面主要介绍非临床睾丸毒性研究相关内容。 1.2.1 临床睾丸毒性评价的困难性 仅很少的临床指征可以用来监测潜在的睾丸毒性，如精子分析、血浆中睾酮、促性腺激素浓度测定；因从输精管损伤到可以通过常规手段(精子分析)检测到损伤往往有着数月的潜伏期，故睾丸毒性实时监测存在着挑战；因为很难在临床试验中通过妊娠率来评价男性生育力，故临床指证的改变与男性生育力影响的关联性有限。 1.2.2 非临床睾丸毒性评价 1.2.2.1 睾丸毒性常规评价方法① 2种属至少4周药物暴露的重复给药毒性试验。② 啮齿类动物雄性生育力评价。③ 动物及人体药动学综合评价。④ 其他，如产前、新生儿或幼年动物暴露后的胚胎一胎仔的生殖和发育毒性研究。 1.2.2.2 非临床研究设计考虑① 雄性生殖毒性非临床研究的剂量选择、给药周期、种属选择，要提供理由。② 除非为了支持儿科用药，一般不推荐使用未性成熟动物进行睾丸毒性评价。这是因为未成年动物的组织学发现无法正确反映生育力的损伤。③ 组织学检查被认为是评价睾丸损伤的最敏感指标，毒性研究应包含睾丸、精囊、附睾和前列腺的病理组织学检查。如果重复给药毒性试验中性腺组织被发现有异常病变，那么在雄性生育力研究中也应进行生殖器官的病理组织学评价。停药后生殖系统不良影响的持续性和可逆性是风险评估的重要考虑点。 1.2.2.3 增加雄性生育力担忧的非临床研究发现及干扰因素 总的来说，可以增加对雄性生育力损伤担忧的雄性动物生殖毒性发现，包括(但不仅限于)睾丸萎缩、生精小管退化或坏死，或其他提示生殖功能损伤的病理改变。可以增加雄性生育力担忧的非临床研究发现有：① 剂量依赖性的毒性发现。② 多个动物种属中均有的相似发现。③ 随着暴露时间增加而持续存在或加重的毒性发现。④ 停药后(尤其停药超过一个生精周期后)仍存在的毒性发现。⑤ 双侧组织中均存在的毒性发现。⑥ 在健康未给药动物中罕见的毒性发现。⑦ 最大无毒性作用剂量与临床暴露量相近(安全窗小)。⑧ 生殖系统脏器重量改变(增加或下降)并伴随病理学改变。⑨ 雄性生育力降低和交配行为减少／弱。⑩ 精子质量(数量、活力和形态)毒性影响。⑩ 在多个生命阶段／生理状态下(成年动物重复给药研究、成年生育力评价、出生前后暴露对成年后的影响、发育过程中生殖器官毒性)均出现的生殖器官和功能的毒性影响。⑩ 抗雄激素样症状：体重降低、雄性生殖器官重量及成熟度降低、攻击性减弱(如嗜睡或交配行为减少)。⑩ 雄激素样症状：雌性动物雄性化、睾丸缩小、生精过程受损。 非临床雄性生育力研究中的干扰因素：① 使用未成年动物。② 导致体重下降的药物，体重降低可能会影响雄性生育力。③ 影响神经肌肉功能、情绪的药物，会影响交配和生育力。④ 不合适的动物模型，药物在该动物种属体内无活性或有不同的药代特征。 1.2.2.4 追加研究 追加的研究主要包括以下评价：① 停药后毒性发现的可逆性阐述。② 性激素分析。③ 靶细胞类型(精子细胞、睾丸问质细胞、支持细胞)检测。④ 精子质量(数量、活力和形态)评价。 2 药物雄性生殖毒性评价的考虑要点 2.1 试验方案选择及阶段性要求 根据ICH及我国生殖毒性指导原则[1-2] ，国内外药物生殖毒性研究最常用的试验方案是三段法试验方案，包括生育力和早期胚胎发育毒性试验(I段)、胚胎一胎仔发育毒性试验(Ⅱ段)、围产期毒性试验(Ⅲ段)。而其中仅I段试验涉及到了雄性生殖毒性评价。根据国内外指导原则及研究现状，对于雄性生殖毒性评价的研究方法主要有以下几方面。 2.1.1 双性别同时给药的I段试验 即雌雄双性别动物均给药后交配，可伴随精子分析和组织学检查，评价雄性、雌性生殖机能、生育力和早期胚胎发育毒性。此方案优势在于减少实验动物使用量、省时省力，对于雄性生殖器官毒性可以给予一定的评价。但是，如果出现生育力或早期胚胎毒性阳性结果时，此方法无法明确毒性作用是由于雄性给药还是雌性给药造成的，或是两者的联合作用。 2.1.2 单性别单独给药的I段试验 即雄性动物给药后与不给药的健康雌性动物交配，雌性动物给药后与不给药的健康雄性动物交配，可伴随精子分析和组织学检查，分别评价雄性、雌性的生殖机能、生育力及其胚胎毒性影响。此方案优点在于可以明确药物生殖发育毒性中雄性或雌性给药的贡献作用，可以更精确地评价药物雄性给药可能产生的潜在生殖和发育毒性。该方法是国外新药研究通常采用的I段试验方法，也是雄性生殖毒性研究的经典评价方法，是FDA新指导原则推荐评价雄性介导发育毒性的标准体内试验[5] 。但是，该方法相对于双性别同时给药I段试验而言，费时、费力、费动物(增加约1倍动物数和工作量)。 2.1.3 结合重复给药毒性试验评价雄性生殖系统影响 主要涉及雄性生殖器官的病理组织学检查、精子分析等。此方案主要优势在于其结合在重复给药毒性试验中同时进行，节省时间和动物，可以提供初步的生殖毒性影响信息。但是，此方法仅能评价雄性生殖器官和／或精子质量毒性，对于雄性生育力及其介导的胚胎发育毒性无法评价。ICH S5(R3)修订的概念文件(concept paper)说明，结合重复给药毒性试验开展生殖器官毒性评估被纳入到指导原则修订内容[8] 。 ICH三方(欧盟、美国和日本)均要求在申请I期、Ⅱ期临床试验时仅提供结合重复给药毒性试验开展的雄性生殖器官毒性评估资料即可，而单独的雄性生育力试验在大规模或和长期的临床试验(如Ⅲ期临床试验)开始前完成即可[9] 。国内研究现状显示，重复给药毒性试验中生殖系统毒性的评价往往未被充分关注，未能全面检测和评估。从保障受试者安全性角度出发，结合我国临床研究风险控制及非临床研究风险识别的特点，我国指导原则要求通常在I期临床试验开始前提供I段(含雄性生育力及早期胚胎发育毒性评价)、Ⅱ段生殖毒性研究资料，以期在临床研究开始前尽可能了解受试物对雌雄动物生殖能力、生殖器官、生殖细胞以及胚胎发育的影响。 I段试验方案选择方面，国外创新药申报资料中大多选择单性别单独给药I段试验，这样可以获得更多的、更直接的药物雄性或雌性生育力与早期胚胎发育毒性信息；而国内申报资料中的I段试验大多采用双性别同时给药。国内这种选择除了考虑省时省力因素外，还可能考虑到国内创新药较多为改良型新药，其同类(相似)品种的生殖毒性较明确或毒性可能较小，且双性别给药试验结果往往均为阴性，所以未再进一步开展单性别单独给药试验。 从国内研究实情出发，作者对I段试验方案的建议：① 采用双性别同时给药I段试验时，若发现有明显的生殖发育毒性时，应补充单性别单独给药I段试验来分别评价雄性或雌性的生育力与早期胚胎发育影响。② 对于同类品种提示有潜在生殖毒性风险的或毒性信息较少的创新药，建议直接选择单性别单独给药I段试验分别评价雄性或雌性的生育力与早期胚胎发育影响。 2.2 动物年龄(性成熟情况) ICH及我国生殖毒性指导原则均明确规定生殖毒性试验通常选用年轻、性成熟的成年动物 。FDA新的睾丸毒性指导原则也指出，除非为了支持儿科用药，一般不推荐使用未性成熟动物进行睾丸毒性评价。因为未成年动物的组织学发现无法正确反映生育力的损伤。 目前国内研究现状显示，参照指导原则相关要求，生育力与早期胚胎发育毒性试验中雄性动物年龄一般可以满足性成熟成年动物要求，然而重复给药毒性试验中雄性生殖毒性评价的雄性动物，尤其猴、犬等非啮齿类动物，常有使用未成年动物的现象。这一现象的根源可能主要在于实验动物年龄不实所致，研究机构往往只能以体重来间接反映年龄，而体重增长较慢的动物其体重无法正确体现其年龄。 案例1：某新药，其大鼠重复给药毒性试验中显示出明显的生殖系统毒性(睾丸、附睾、子宫、卵巢萎缩)；大鼠I段生殖毒性试验也发现了生殖器官相似的毒性，并且精子活动率及精子数量明显下降、精子畸形率升高，交配率、妊娠率、生育率明显降低；然而猴重复给药毒性试验中，并未显示类似的生殖毒性。通过查阅猴病理学检查结果发现，试验所用的雄性猴中大部分(16只／25只)未性成熟(睾丸、前列腺、精囊腺未成熟、附睾管内无精子)，故无法充分评价本品对猴雄性生殖系统的影响。 案例2：某新药I段生殖毒性试验中，研究者认为“为评价受试物对雄性动物精子成熟度、交配行为、受精的影响，雄性动物应从未性成熟期至交配结束时为止连续给药”，故其雄鼠购入时鼠龄为4～5周。这是一种误解，精子从未成熟到成熟与动物从未性成熟到性成熟是2个概念，评价精子成熟影响并非要从未性成熟期开始给药。建议在性成熟后进行给药，如在幼龄期开始给药，即便交配时达到性成熟年龄，这种情况下若出现精子毒性可能不仅仅是对精子形成及成熟的影响，还可能包含了对幼年动物生长发育过程中生殖系统发育及其他系统整体毒性的影响。 2.3 生育力试验雄性动物给药周期的选择 国内生殖毒性指导原则[2]要求，可根据至少1个月的重复给药毒性试验结果确定雄性动物交配前给药时间的长短，一般为4～10周。如果在1个月以上的重复给药毒性试验中未发现任何毒副作用，那么在交配前雄性动物给药周期可缩短至4周。ICH S5(R2)指导原则[1]认为，如果在至少2周的重复给药毒性试验中未发现任何毒副作用，那么在交配前雄性动物给药2周便可。 ICH s5(R2)指导原则上述规定主要基于日本和欧洲的研究规范和研究结果[1] 。日本及欧洲研究综合表明：雄鼠交配前给药2，4或9周，在发现雄性生殖毒性上具有相同效力，延长交配前给药时间并不能发现更多的毒性。日本实验室间联合研究显示：① 选择性影响雄性生殖的受试物是罕见的。② 影响精子发生的受试物几乎全作用于减数分裂后期，并影响睾丸重量。③ 雄性生殖器官组织病理学检查，是检测精子发生毒性的一种更为敏感和快捷的方法；对精子发生的潜在毒性信息可以在重复给药毒性试验中获得，精子分析可以提供类似于病理检查的结果信息。④ 与雌性动物交配，是一种不敏感的检测精子发生毒性的手段，尚无仅通过雄性动物给药9～10周并与雌性交配，发现雄性生殖毒性的例子。 然而也有学者指出雄性大鼠交配前给药周期超过9周比较稳妥[10] ，其主要理由：在1个月以上的重复给药毒性试验中，通常很难对生殖系统的毒副作用观察得特别全面和详细；动物激素水平上的毒副反应是比较错综复杂的，让供试品充分暴露，多一些时间给药，多一些时间观察比较稳妥；大鼠精子发生(包括精子成熟)整个过程需要63d。 综合“可短”、“宜长”这两方面的声音，作者对于雄性动物交配前给药时间选择的建议：① 具体问题具体分析，兼顾科学性、合理性、风险效益评估。② 在规范、仔细的重复给药毒性试验(尤其雄性生殖器官组织学检查)未发现明显毒性反应结果的支持下，按照指导原则要求可以采用最短的4周时间；但目前来看，前述先决条件通常不能获得或在生殖毒性试验开展前无法获得，此时采用4周时间风险很大。③ 对于同类品种提示有潜在生殖毒性风险的或毒性信息较少的创新药，建议采用较长的给药时间，并配合仔细的精子分析和生殖系统病理组织学检查。 2.4 雄性生殖毒性评价指标的选择[1-2,4-6,11-12] 2.4.1 常规I段生殖毒性试验中的雄性生殖毒性评价 常规毒性指标：雄性动物的一般体征和死亡情况、体重、摄食量。 生殖器官检查：大体观检查、脏器重量和系数、以及必要时的病理组织学检查。常规评价的雄性生殖器官主要有睾丸、附睾、前列腺、精囊腺、输精管等，其中睾丸、附睾为最主要评价器官。病理组织学检查在雄性生殖毒性风险评估中起着重要作用。建议开展生殖器官组织学检查的情况主要有：生殖器官大体观检查发现明显的毒性改变；脏器重量和系数检查发现有明显异常；或已有资料提示该药物有生殖毒性潜能(包括重复给药毒性试验已显示有生殖系统毒性)；或该药物用于生育调节等生殖系统相关适应证。 精子分析：主要包括精子数量及精子活力分析、精子形态学(畸形)检查。其中精子数量及精子活力分析为最常用指标，建议利用计算机辅助精子分析仪(CASA)进行全自动分析。一方面，CASA系统避免以往人工显微镜计数及活力定性分析中的人为干扰，增加了结果的可靠性；另一方面，CASA 的精子分析指标(尤其活力指标)更加全面、细致，分析指标，如精子总浓度、精子总密度、各运动状态(静止、活动、慢速、中速、快速、超快速)精子浓度、各运动状态精子百分率、平均路径速度、直线运动速度、曲线运动速度、精子头部侧摆幅度、精子鞭打频率、前向性、直线性、精子头长宽比、精子头部面积等，这些指标全面分析了精子数量、精子运动活力及精子运动方式等方面的精子质量。目前国内已有多家GLP研究机构采用了CASA系统。对于精子畸形分析，鉴于形态学观察的直观性以及显微镜观察精子畸形技术较为经典、较易操作，建议通过常规涂片一固定一伊红染色后镜下观察。精子分析仪提供的荧光染色精子畸形自动分析系统，提供了一种高通量分析的可能，但此方法对于精子畸形的标准需人工设定，较复杂、主观性较强、个性化分析不够，在大批量分析精子形态过程中相对传统镜检假阳性和假阴性结果较多；且需荧：光染料，检测成本较高。 生育力指标：雄性动物给药后与雌性动物交配，得到生育力相关指标，主要有：交配指数或率(交配成功动物数／合笼动物数)、生育指数或率(妊娠动物数／合笼动物数)、妊娠指数或率(妊娠动物数／交配成功动物数)、交配成功天数(从合笼到交配成功所用天数)等，以评价药物对于雄性生育力的影响。性行为的影响因素比较复杂且啮齿类动物性行为往往在夜间进行，故对于常规啮齿类动物交配性行为的影响一般不直接评价，而是通过阴道栓或含精子阴道涂片结果作为交配成功的间接证据，从而间接评价药物对交配性行为的影响[4] 。 胚胎发育毒性指标：交配后的妊娠雌性动物一般在器官形成期结束时(如大鼠妊娠d 13～15)解剖，检查黄体数、活胎、死胎、吸收胎、着床数、着床前丢失、着床后丢失等，以评价药物雄性动物给药后对其子代(胚胎)早期发育的影响。必要时可延迟解剖期至临产前，参照Ⅱ段生殖毒性试验方法检查胎仔的外观、内脏和骨骼发育毒性。FDA雄性介导发育毒性评估指导原则[5]指出，若雄性单性别给药试验出现发育毒性信号时，应该考虑开展追加试验，使妊娠动物孕期延长至临产前再行解剖检查，以期获得更全面的发育毒性指标。 性激素指标：对于可能影响下丘脑．垂体一性腺轴通路信号、或已有证据显示有明显的生殖毒性潜能、或用于生育调节的药物，为更多地了解其可能的 生殖毒性影响机制，建议增加检测血清中性激素水平。雄性动物性激素指标主要有：睾酮(T)、雌二醇(E：)、双氢睾酮(DHT)；雌性动物性激素指标主要有：雌二醇(E2)、孕酮(P)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)和睾酮(T)。其中T，E2为最常用指标。性激素水平影响的评价应结合生殖毒性结果以及其他毒性或药效试验结果进行综合分析，探讨可能的影响规律。 2.4.2 重复给药毒性试验中的雄性生殖毒性评价 生殖器官检查：大体观检查、脏器重量和系数以及病理组织学检查。这些检查均为重复给药毒性试验常规检查必做指标的一部分，是大多数重复给药毒性试验中仅有的针对雄性生殖毒性的评价指标。 精子分析：结合在动物解剖时检测雄性动物的精子数量和活力。一般主要在非啮齿类动物(如猴、犬等)中增加此分析，以验证或是补充常规I段试验动物(大鼠)中精子毒性的结果，为临床试验提供外推性更好的动物毒性依据。 性激素水平检测：重复给药毒性试验一般早于单独的生殖毒性试验，其性激素水平的检测有助于为后续的生殖毒性评价提供科学参考。 2.5 毒代动力学 与重复给药毒性试验的毒代动力学分析不同，生殖毒性试验的毒代动力学分析主要用于阐明生殖毒性结果与系统暴露量(亲代和／或子代)的关系，而不是简单描述供试品在动物(亲代)体内的基本药动学特征；生殖毒性试验毒代动力学分析，有助于不同毒理学试验结果间通过暴露量进行科学合理的比较，为临床用药的风险评估提供参考。其毒代动力学数据除来自亲代动物的血浆暴露量外，还可以来自生殖器官组织或体液(如睾丸、精液、乳汁)及子代胚胎／胎仔数据，重点评价药物和／或代谢产物能否通过血睾屏障、血乳屏障及胎盘屏障。其中雄性生育力与早期胚胎发育毒性试验中，常见的毒代药物浓度检测生物样本有雄性动物血浆、睾丸组织、精液，重点分析药物透过血睾屏障的能力。 我国生殖毒性指导原则中建议创新性药物生殖毒性试验进行毒代动力学研究。FDA雄性毒性2个新指导原则中对毒代动力学分析也均有相关要求，尤其雄性介导发育毒性风险评估中，精液中药物含量的测定对于由“精液-阴道摄入”途径介导的胚胎-胎仔发育毒性的风险评估至关重要。胎仔暴露水平的推算是在假设精液中药物浓度等于血药浓度Cmax 的基础上推算的最大可能暴露量。若胎仔暴露水平低于发育毒性NOAEL剂量10倍以上，可以不要求进一步的雄性介导发育毒性风险的评估[5] 。 国内雄性生殖毒代研究现状：国内生殖毒性毒代分析开展较晚，仍在起步阶段，指导原则中仅是建议创新药开展；近年来，随着重复给药毒性毒代的认识、要求及研究水平的提高，生殖毒性毒代得到了一定的重视，但仍不够；目前大部分国内药品注册申报资料中生殖毒性试验仍无毒代分析，而在开展毒代分析的生殖毒性资料中毒代指标也往往仅为类似于重复给药毒性毒代分析的亲代动物血药浓度相关指标，缺乏针对生殖毒性的组织或子代的暴露量析。 2.6 结果分析的综合评价特性 非临床研究重在综合评价，研究的各项结果之间，以及与其他非临床研究结果之间往往存在着有机的联系与规律。生殖毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个有机组成部分。生殖毒性研究不能与药效学、药动学和其他毒理学研究割裂，试验结果应力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充[11] 。在雄性生殖毒性结果的评价中，应根据生育力试验各项指标结果(生殖器官、精子、生育力、胚胎发育及性激素水平等毒性影响)，以及重复给药毒性中雄性生殖器官毒性相应结果，并结合药物的同类品种生殖毒性或可能的药理学作用特征等，综合分析药物对于雄性生殖毒性的影响及其可能的作用规律。雄性生殖毒性评价的最终目的是将毒性结果向临床过渡，预测潜在毒性，为临床试验及上市后应用降低男性用药所带来的生殖与发育毒性风险，制定临床剂量、监测及防治措施，限制用药人群提供科学参考，有利于研发人员及上市后医生和患者进行利弊权衡。 参考文献： ［1］ICH. 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药审要点 ｜ 药物临床前安全性评价中脾脏的作用和意义 文章来源：医学研究杂志 2010年1月 第39卷 第1期 药物临床前安全性评价 中脾脏的作用和意义 林 志 李珊珊 张 颐 杨艳 伟 李 波 （中国药品生物制品检定所／国家药物安全评价监测中心） 脾脏是静脉给予药物后引流的部位。脾脏两个主要的功能区域是造血的红髓和富含淋巴的白髓。白髓位于动脉周围，包括动脉周围淋巴鞘(T细胞)、比邻的滤泡(B细胞)和边缘区(B细胞)。边缘区位于红白髓之间，但边缘区与红髓的连接处并不是很清晰。此外,边缘区包含一种特殊的巨噬细胞。不同种属动物的脾脏具有相似的结构，但是大鼠的边缘区比较突出。 根据STP指导性文章，免疫系统的常规病理学评价中淋巴器官每一分隔区域应该分别进行评估,并且推荐采用描述性的术语而不是解释性的术语[1]。因此，脾脏中动脉周围淋巴鞘(PALS)、淋巴滤泡、边缘区以及红髓应该分别就其大小和细胞构成的变化进行记录。此外，淋巴滤泡生发中心要注意其是否存在细胞增生或减少的改变。给与免疫调节剂后可以在PALS和(或)边缘区观察到其大小和细胞密度的变化，并且在生发中心看到淋巴滤泡数目的改变。有报道当存在潜在的免疫毒性时，滤泡细胞构成密度和生发中心发育的测量是最敏感的预测指标，而红髓中细微的变化通常很难观测到[2-4]。 一、脾脏的结构和功能 作为造血器官脾脏由丰富的纤维肌性血管组成，因而其复杂的血管系统成为血液中外来或感染物质的过滤场所。运动型动物，包括大多数的食肉动物、犬和猫类以及马，其脾脏的血管有明显的肌层，在奔跑时血管收缩将多余的血液注入循环血液中。相反，反刍动物和大多数实验动物脾脏含较多的结缔组织，其血管多数时间处于扩张状态，其体积不会出现明显和快速的变化。脾脏通过血液接触抗原，它没有输入的淋巴管但有输出的淋巴管。脾脏的大动脉分支成为肌性动脉，这些肌性小动脉周围是密集的淋巴细胞，紧靠的是T淋巴细胞，外层为骨髓来源的淋巴细胞。这些淋巴细胞共同组成了动脉周围淋巴鞘(PALS)。从肌性动脉分枝的第3级动脉将抗原递呈给生发中心的树突状细胞。其他的动脉最终成为多排的小静脉或筛状静脉，将血液输送到静脉窦和滤过系统。通常大多数血液直接通过脾脏再回到血液循环系统中，只有3％的血液进入滤过系统的静脉窦，在这里外来物质和衰老的红细胞被清除。因此，所有血液每天至少1次通过脾脏的滤过系统1次。大的巨噬细胞黏附在具有孔隙的静脉窦，呈现为隆起、胞膜皱褶，这很适合巨噬细胞捕捉衰老的血细胞。脾脏红髓血流较慢的区域中血糖、pH值以及胆固醇都降低，而这对于经过此的血细胞是有损伤的，尤其是红细胞。脾脏滤过系统中静脉扩张时途经此处的细胞停留时间延长，借此衰老的红细胞被巨噬细胞从血液中清除。 二、大体病理学改变 对脾脏为环境解剖结构的理解有助于帮助我们认识脾脏大体病理学的改变。比如在巴比妥麻醉下从新鲜死亡动物身上摘下的脾脏呈急性肿胀改变，但在大体检查中脾脏将持续收缩，血液将慢慢渗出。然而，慢性肿胀改变的脾脏往往静脉窦中细胞构成增加，呈现一个较干的切面。脾脏的生发中心在滤泡型B细胞淋巴瘤的动物中其大体观察非常明显，因为该病变为灶性并局限于脾脏的生发中心。同样，在淀粉样变的脾脏其生发中,大体观察也非常清晰，该病变也以局灶性的方式局限于生发中心，使得新鲜脾脏标本切面上肉眼可观察到蜡样灶，也称为“西米脾(sagospleen)”。在恶病质的动物中，脾脏体积小，相对血细胞较少，脾脏内比较干，切面呈纤维化的改变。 三、组织病理学评价 1．白髓的组织病理学改变：PALS区域细胞构成的减少通常存在于放射、病毒或药物导致的T细胞的坏死或凋亡。无胸腺动物同样可以在这些富含T细胞的区域出现细胞构成的减少[3]。同样，富含B细胞的区域也可以出现特殊的细胞构成的减少。尽管这种处理因素导致的改变较少出现，但随着新免疫调节药物的研发这种改变也可能逐渐地增多。这种改变可能暗示T细胞非依赖的体液免疫应答的缺乏。N，N二甲基一P一甲苯胺和叠氮胸苷／美沙酮HLC能够导致白髓面积和细胞构成的全面减少。PALS区域细胞构成的增加可以在某些特定的化学物质处理后观察到，例如柠檬醛和雄烯二酮等。但是，在胸腺T细胞性淋巴瘤的早期转移灶和其他淋巴瘤、白血病中也能观察到这些区域细胞构成的增加。急性抗原诱导的免疫应答可以致B细胞区域细胞构成增加，在次级淋巴滤泡生发中心比较明显。抗原刺激将诱导不成熟的B细胞或免疫母细胞的增生。这些细胞比成熟的淋巴细胞体积要大一些、染色较浅、核膜明显呈圆形、边界清晰。他们将成熟为产生免疫球蛋白的浆细胞，然后进入红髓。患单核细胞型白血病(MCL)的F344大鼠由于边缘区存在大颗粒淋巴细胞(白血病细胞)的浸润使得该区域细胞构成明显增加。白髓细胞构成的显著增加有时很难与肿瘤病变区别[4]。 2．红髓的组织病理学改变：红髓中淋巴细胞的改变也应该进行评价。在淋巴细胞破坏的情况下可能会见到反应性髓外造血。这种情况要注意与患MCL的F344大鼠红髓中大颗粒淋巴细胞的浸润相区别。这种情况也有可能存在，在系统中淋巴细胞数目显著减少时红髓中的淋巴细胞数目也减少。尽管红髓中存在淋巴细胞和巨噬细胞，红细胞仍是红髓中的主要细胞。因此，脾脏的大小和重量以及组织学差异较大，它与麻醉的方式和解剖时放血的情况相关。然而，脾脏重量由于放血造成的差异在犬和猴中明显，而不同于大鼠。有证据表明脾脏重量是免疫毒性一个不敏感的指标。脾脏重量当与剂量相关联以及存在组织病理学改变时才具有一定的毒理学意义[5]。 尽管红髓在免疫刺激应答中可以发生变化，其他的影响因素也不能忽略。比如循环改变、髓外造血、巨噬细胞聚集、纤维组织增生以及色素沉着等。以上脾脏红髓的病理改变可能都与药物或化合物有关，因而在进行药物安全性评价应该注意脾脏的病理形态改变。 3．老年化病变：老年化的大鼠和小鼠中B细胞丰富的滤泡和边缘区细胞构成会增加而浆细胞不会有明显的增加。老年大鼠肿大的脾脏中可观察到淋巴细胞构成减少及髓细胞增加，尤其是SD大鼠，但其病因学不清楚。 4．其他细胞及病变：这些细胞的存在、严重程度及定位也需要注意，即浆细胞、凋亡细胞、易染体巨噬细胞、含色素颗粒的巨噬细胞、粒细胞和造血细胞。尽管肉芽肿、巨噬细胞聚集、纤维化和坏死不是主要的组织病理学变化，但其在脾脏的评价中也需要注意。在致癌性研究以及致敏性试验中，对于脾脏细胞构成的改变也需要注意。有报道在过敏性研究中采用局部淋巴结分析(LLNA)可以更为客观地评价脾脏中淋巴细胞的增生[6]。 四、展望 目前，关于脾脏毒性研究随着新技术新方法的开展也逐渐进入了一个崭新的领域。脾脏毒性分子机制的研究成为各国学者研究的热点。研究发现,脾脏纤维化可能是脾脏的重要的瘤前病变。苯胺致脾脏纤维化以及瘤形成中上游信号AP一1和NF—KB的活化是其病变发生发展的重要步骤[9]。此外，转基因小鼠以及基因敲除小鼠的应用对于探讨药物导致的毒性机制研究具有重要意义。全氟辛酸的毒性研究发现小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞数目减少，呈萎缩的改变。采用过氧化物酶体增生物激活受体(PPARa1．pha)基因敲除小鼠中全氟辛酸所致的脾脏萎缩可以明显消减，因而考虑全氟辛酸所致的免疫调节是部分通过了过氧化物酶体增生物激活受体而起作用的[10]。总之，多种新方法新技术的应用促进了人们对于药物／化合物诱导的脾脏分子病理机制的研究和探讨。 脾脏是推荐进行组织病理学评价的主要淋巴器官，其在药物临床前安全性评价中具有重要的意义。外来物质或代谢产物的免疫毒性可以造成脾脏的损伤，影响脾脏中淋巴细胞的构成[11]。深入探讨脾脏组织病理学变化的特点有助于更清晰地认识药物诱导的免疫毒性损伤，为我国新药研发以及药物的临床前安全性评价提供更科学的依据。

药审要点 | 药物非临床安全性评价中肾毒性指标的分析 文章来源：中国药理学与毒理学杂志,2018,32(10):754-756. 药物非临床安全性评价中肾毒性指标的分析 Risk assessment of indicators in non-clinical safety study withdrug-induced nephrotoxicity implications 宁娜 1，朱飞鹏 1，王和枚 2，贺学林 1，3，韩玲1 （ 1. 国家食品药品监督管理总局药品审评中心；2. 北京昭衍新药研究中心股份有限公司；3. 浙江大学附属第一医院 ） 摘要：预测新药肾毒性的过程是一个客观、严谨的分析与评价过程，数据链的完整是其必要条件。反映肾毒性的主要检查项目包括尿检、血液生化检查、大体解剖、脏器质量以及组织病理学检查等，如何准确、客观地评价异常指标是药物非临床研究及后续临床试验中需要重点考虑的问题。本文综述了非临床肾毒性指标及其评价思路，为用药风险点的确定和临床试验方案的设计提供参考。 关键词：肾毒性；肾病；生物标志物；组织病理学 肾是药物或其毒性代谢产物富集、排泄的重要器官。近年来，因疾病谱复杂化、联合用药等，药源性肾毒性已成为导致急性肾损伤的重要原因之一[1]。据有关研究报道，全球进入非临床研究阶段的候选化合物只有7% 因肾毒性而中止[2]，非临床研究的肾毒性评价可能被低估。非临床安全性评价中，可提示肾毒性风险的常规指标包括尿量、尿蛋白、血清肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和组织病理学观察结果等，如何对异常指标进行深入评价是新药非临床研究及后续临床试验中需要重点考虑的问题。本文对非临床肾毒性指标及其评价思路进行综述，为临床试验中风险点的设置提供参考。 1 肾毒性指标异常与药物的相关性 在非临床安全性评价中，直接或间接反映肾损伤的检查项目主要包括针对尿液和血液的临床病理学检查，以及针对肾的大体解剖和组织病理学检查。临床病理学检查中，尿检的主要指标包括尿量、尿蛋白、尿潜血、尿糖和酸碱度；血液学指标包括红细胞系数（红细胞、血红蛋白和红细胞比容）及相关网织红细胞计数等；血生化指标包括Cr、BUN、尿酸和电解质含量（如磷、钙和钾）等，可从不同的角度反映肾功能减退的程度和持续的时间。而肾的组织病理学病变一般先于临床病理学指标出现[2]，动物实验时，通过实验室常规染色法（如苏木精-伊红染色等），可观察大部分的病理变化，如空泡变、色素沉积、细胞坏死和炎症细胞浸润等。 非临床安全性评价应综合考虑多个指标的相互印证，判断其与药物的相关性。如某案例中，给药后雄性大鼠出现尿蛋白阳性，组织病理学检查可见肾近端小管上皮内存在轻度玻璃样小滴和散在的透明管型等病理改变。由于不良反应的严重程度存在性别差异，研究者初步推断可能与雄性大鼠特有的α2u球蛋白肾病有关。α2u球蛋白是正常大鼠肝合成的一种小分子蛋白质，经肾小球滤过，约50%在近端小管重吸收，溶酶体降解。α2u球蛋白肾病具有性别和物种特异性，只发生于雄性大鼠。外源性物质如与α2u球蛋白发生可逆性结合，可降低溶酶体蛋白酶的降解能力，导致其在溶酶体内蓄积，使溶酶体数量增加、体积增大，从而在近端小管S2段形成特征性的玻璃样小滴蓄积，进而发生单个细胞坏死、近端小管和髓袢细段连接处出现颗粒管型等病理改变[3]。人类很少或不存在这种蛋白。若能确定尿蛋白阳性和组织病理学的玻璃样小滴、透明管型是由α2u球蛋白引起的，则可认为该药物在临床使用不会引起类似肾毒性[4]。但是，非临床安全性评价是一个客观、严谨的分析与评价过程，不能仅根据单个组织病理学观察结果疑似种属特异性病变，就得出与人不相关的结论。该案例的数据链缺少玻璃样小滴是α2u球蛋白所致的直接证据，尚不能推断尿蛋白阳性及玻璃样小滴变性因α2u球蛋白引起。为此，研究者进一步使用α2u球蛋白抗体进行免疫组化实验，结果未见抗原抗体结合的阳性染色，直接排除了玻璃样小滴为α2u球蛋白的可能性。同时，对各个实验组的肾组织病理学切片进行复阅，发现除近曲小管的玻璃样小滴外，尚可见肾小管嗜碱性病变、上皮细胞变性、胞浆嗜碱性和透明管型等严重程度呈剂量相关性。上述变化与慢性进行性肾病（chronic progressive nephropathy，CPN）的早期组织病理学变化基本一致[5]。CPN 是实验大鼠高发的自发性肾病，发病率和严重程度受到蛋白质或热量摄入、雄性激素、肾蛋白处理能力等多种因素的影响，最早在大鼠2~3 月龄时即可出现[6-7]。但是，案例中肾小管嗜碱性病变和部分上皮细胞变性等病变的严重程度与药物剂量相关，无法排除上述病变与给药的相关性。但根据组织病理学检查结果中多个特征性改变，本案例认可近曲小管的玻璃样小滴为大鼠自发性病变CPN 的表现，但药物促进了自发性肾病的发生与发展。至此，研究者应根据药物相关不良反应的严重程度、可逆性等进行利弊权衡，判断是否在非临床研究阶段中止研究，还是在后续临床试验中将肾毒性作为风险点进行严格控制。 完整的数据链是预测临床肾毒性的必要条件。非临床安全性评价时，应对异常病理指标进行充分分析和解读，根据相互印证的数据判断病变出现的类型、严重程度、进展情况与药物理化性质、给药剂量、动物性别等的相关性，分析病变出现的原因以及药物导致肾损伤的可能机制，提示临床使用的风险点。同时，充分考虑种属特异性病变或动物自发性病变的特殊表现，与实验动物的不良反应进行对比，有针对地进行确证后，方可排除与药物的相关性。 2 非临床肾毒性指标的进一步探索 在新药开发过程中，考察指标的局限性可能将影响毒性评价的准确性。组织病理学检查受到取样和工作量的限制，而临床病理学的常规指标中，尿蛋白、血清Cr 和BUN 等的变化对于提示肾早期病变相对滞后，血清钙磷代谢的异常等主要反映晚期慢性肾功能障碍，同时也缺乏特异性。探索早期、敏感的检查指标是改善非临床肾毒性低估的重要途径之一。作为反映肾损伤的生物标志物，应满足下列条件：① 样本获取简易，室温下稳定；② 正常情况下，在肾中表达水平较低或不表达，损伤后表达明显增加；③ 肾功能恢复前稳定表达；④ 表达水平达到临床病理学分析的检测限。目前，人用药物技术要求国际协调委员会（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）认可7 种早期肾损伤的尿生物标志物，分别为白蛋白、β-微球蛋白、血清胱抑素C（cystatin C）、肾损伤分子1（kidney injury molecule - 1，Kim - 1）、三叶肽因子3（trefoil factor 3，Tff3）、丛生蛋白（clusterin）和肾乳头抗原1 （renal papillary antigen-1，RPA-1）［2］，作为常规指标尿蛋白、血清Cr 和BUN 的补充，可用于非临床肾毒性的评价。白蛋白因同性电荷相斥作用而无法通过肾小球滤过膜，可用于判定肾小球滤过膜功能变化。β-微球蛋白和血清胱抑素C 的相对分子质量较小，且不与其他蛋白结合形成复合物，可自由地经肾小球过滤到原尿中，在近曲小管重吸收并代谢分解，可反映肾小球滤过功能和近端肾小管重吸收功能。Kim-1 是近曲小管上皮细胞的一种跨膜糖蛋白，在受损后再生的细胞中高表达，可较早地反映近曲小管的损伤程度。Tff3是一种小分子肽类激素，主要由上皮细胞分泌。丛生蛋白是一种细胞外糖蛋白，肾急性缺血时表达增加。RPA-1 是一种特异性分布在肾集合管的膜结合糖蛋白，与肾乳头损伤程度有较好的相关性。在安全性评价中，敏感的检查指标可及时、快速地反映肾毒性，甚至在更早期的候选化合物发现阶段，通过体外筛选实验等即可提示化合物的肾毒性。 肾组织病理学改变仍然是非临床肾毒性评价的金指标［2］。常规组织病理学检测如不能满足对病变部位和性质的鉴别，则需要进行特殊染色处理，如过碘酸六胺银染色（periodic acid-silver methera⁃mine，PASM）、过碘酸- 希夫染色（periodic acid -Schiff stain，PAS）染色和Masson 染色等；同时，可通过特殊生物标志物检测和电镜观察等进一步明确病变特征，分析病理机制。组织病理学检测对病理诊断人员要求较高，不同诊断人员常得出不同的病理检查结果。因此，应统一病理诊断术语，并开展病理学家的资质认证，提高病理诊断质量。组织病理学诊断术语和诊断标准的国际规范即大小鼠损伤命名和诊断标准国际协调规范（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesion in Rats and Mice）对大小鼠的增生与非增生性病变术语与诊断标准已做了统一规定，对规范病理诊断、促进国际间或不同机构间病理学家以及药物监管部门之间交流起到了积极的推动作用，受到广泛认可。国内毒性病理学专业人员及药物监管机构应尽快熟悉或了解。在日常药物非临床研究的病理检测中，应根据实际需要开展必要的内部或外部组织病理学检查同行评议，确保病理学检查结论准确可信。 3 结语 新药研发是一个依据数据不断向前推进的风险控制过程。非临床安全性研究是其中不可或缺的重要环节，可为临床试验提示需关注的用药风险点，并为药物上市后安全、合理用药提供数据支撑。在某些方面，还可预测临床研究中监测指标不能反映出来的潜在毒性。在对新药肾毒性风险进行评估时，应结合完整的非临床安全性研究数据链，总结病变的发生率、严重程度和可逆性，分析与药物剂量的相关性；同时综合药物作用机制、动物种属特点及自发性病变研究等进行分析，评价与人的相关性，以降低临床用药风险。 参考文献： ［1］ Luyckx VA，Naicker S. 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