组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析
药审要点 ｜ 组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析
文章来源：中国新药杂志2016 年第25卷第6 期：634-638
组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析
余珊珊1，王海学1，胡晓敏1，林志2，邱云良3，王庆利1
(1 国家食品药品监督管理总局药品审评中心; 2 中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心; 3 国家上海新药安全评价研究中心)
摘要：单克隆抗体( mAb) 类药物是当今生物制药研发领域的热点，组织交叉反应( TCR) 试验作为单抗类药物临床前安全性评价的重要部分通常在Ⅰ期临床试验之前完成，可为临床毒性预测和监测提供重要线索。本文将结合单抗研发和审评案例，探讨并总结单抗类新药研发中 TCR试验的相关指导原则以及审评考虑。
关键词：单克隆抗体; 组织交叉反应; 生物药研发; 药品审评
单克隆抗体( mAb) 类药物通常具有特定的免疫特性，除与适应症相关特定靶部位抗原结合外，若人体正常组织中存在相同或相似的抗原决定簇，还会与靶器官外的组织或细胞结合从而产生严重的不良反应［1］ 。
组织交叉反应( tissue cross-reactivity，TCR) 试验是指在体外检测单抗或相关抗体样生物制品与组织上的抗原决定部位结合的试验，目的是确认受试抗体与药效靶组织抗原决定部位的结合，检测抗体是否与非靶部位组织抗原( 如组织交叉反应抗原) 结合，确定非临床安全性试验相关动物种属，以及预测毒性靶器官。相关动物种属是指表达与人相同的靶抗原并表现出相似的组织交叉反应特性的动物种属［2］。TCR试验通常采用免疫组织化学技术 ( im-munohistochemical，IHC) 对一系列人和动物的冰冻组织切片进行染色。近年来，随着新技术的发展，组织芯片、Western Blots、流式细胞( 对培养细胞或外周血样本) 等试验技术也开始应用于TCR 试验［3］。
单抗类药物近年来由于具有广泛的临床应用前景已成为生物制药研发领域的热点，TCR 试验作为评价单抗类药物临床前安全性的重要手段，为药物临床毒性预测和监测提供了重要参考信息，本文将结合案例概括并探讨单抗类新药研发中 TCR试验的相关技术要求和评价考虑。
1 关于 TCＲ 试验在新药研发评价中应用的相关技术指导原则
国际上已发布的涉及 TCＲ 试验的技术指导原则主要包括 FDA 的 PTC 指导原则( 4 个版本) 、ICH S6 以及 EMA 发布的相关指导原则，对 TCＲ 试验的科学和技术性进行了阐述。2003 年 3 月 20 日，我国发布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》，有关组织交叉反应的内容在该指导原则的临床前研究部分［4］。
1. 1 PTC 指导原则的发展
1983 年，FDA 发布了最早涉及TCR 的指导原则，即 Points to Consider for the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use( 简称 PTC) 。随着工业界和监管机构对 TCＲ 认识的深入，该指导原则后来经历了 1987，1994，1997 3 个版本，不断深化对 TCＲ 试验目的、定义、组织材料、试验方法的认识。至1994 年，经过 3 版沿革的 PTC 指导原则指出TCR 试验的目的是发现和确定药物体内毒性试验相关动物种属; 受试物应与临床试验使用的受试物一致，且应在 I 期临床试验之前完成; 为覆盖人类基因的多态性，TCR 试验组织材料应为来源于至少 3 个无血缘关系的捐赠者的快速冷冻组织 ( 对于动物试验，来源于 2 只无关捐赠动物的组织材料即被接受) ，不再使用化学固定组织，首选手术来源的样本或经过良好保存的尸体来源组织，并在附录中列出了 32 个常用的人组织［5］; 试验技术要求方面，指导原则建议定量检测组织交叉反应并设置阴性和阳性对照，由于一般的组织细胞中均有转铁蛋白受体的表达，此以抗转铁蛋白受体抗体为阳性抗体，作为阳性对照中的“外部照”［5］; 建议根据抗体亲和力和预期血药峰浓度选择试验抗体浓度; 提出使用纯化抗原抑制试验区分潜在的非特异性交叉反应 ( 包括 FCR 介导的非特异性结合) 和由抗体互补决定区介导的特异性交叉反应。
试验方法方面，IHC、微量细胞毒性方法、免疫荧光抗体和 / 或自显影技术、集落形成试验( Cloning Forming Assay，主要用于检测血液和培养细胞的组织交叉反应) 、免疫细胞化学或其他合适的新方法都适用于TCR的检测。
1994 年版的 PTC 认为对于非结合单抗，若未检测到受试抗体与人组织的交叉反应性，且无表达相关抗原的动物和疾病模型，动物体内毒性试验建议仅需进行一般安全性试验; 无论有无与人组织的交叉反应或相同的靶抗原，单抗都应进行药动学和组织分布试验。该版指导原则提高了对有细胞毒性结合抗体的安全性关注。
1997 年第 4 版 PTC 指导原则问世［6］，首次提出TCR试验应检测多个抗体浓度，且最佳抗体浓度应为能与靶器官有效结合的最低浓度; 对于非结合单抗，若无与人组织的交叉反应，且无表达相关抗原的动物和疾病模型，可不进行动物体内毒性试验; 针对具有细胞毒性的结合抗体该版提出了更高的安全性试验的要求，明确指出若存在与人非靶组织的交叉反应性，通常应使用一种以上动物进行多剂量和重复给药的体内毒性试验。
1. 2 ICH S6 和 EMA 关于 TCR的指导原则
1997 年，ICH S6 与第 4 版 PTC 同年发布，在政策层面上强调 TCR 对于选择毒性试验相关动物种属的重要意义，同时明确了相关动物种属的定义—由于具有相关受体或抗原，受试单抗在其体内具有药理活性的动物种属。此外，ICH S6 指出，除 IHC 试验外，免疫化学或其他新技术皆适用于相关动物种属的选择; 当无表达靶抗原的相关动物种属时，若有动物表现出与人相似的非靶组织交叉反应，建议采用该种属动物进行体内毒性试验。然而，ICH S6 在 2011 年修订的附件( 第二部分) 注释中指出，动物组织的TCＲ 研究对选择相关动物种属的指导意义可能具有局限性。例如当候选药物不是好的 IHC 反应物时，TCＲ 试验从技术上可能是不可行的［7］。
2007 年，EMA 的“Guideline on Strategiesto Iden-tify and Mitigate risks for First-In-Human ClinicalTri-als with Investigational Medicinal Products”同样建议主要依据 TCＲ 试验结果选择体内毒性试验相关动物种属，并提出应结合靶部位抗原特性( 如表达、分布、一级结构) 和药效终点指标( 如结合占位、功能性后果 founctional consequence、细胞信号、药动学特性、代谢) 等因素综合分析TCR的试验结果［8］ 。
此外，EMA 颁布的 TCR待测组织与 FDA 的 PTC( 1997版) 内容略有不同，EMA 补充了腮腺、周围神经和扁桃体，去除了乳腺、结肠、眼球、输卵管、胎盘、前列腺、脊髓、输尿管和子宫［2］。
1. 3 我国关于 TCR的指导原则
我国相关指导原则对TCR试验在非临床试验中的定位和具体技术要求与国际主流认识基本一致，要求对具有细胞毒性的结合抗体要求进行更广泛的非临床安全性试验; 对于来源于肿瘤相关抗原的单抗，建议进行与各种人肿瘤组织的交叉反应性试验。
2 TCR 试验的发展现状和面临的问题
1997 年至今，TCR试验主要用于检测单抗类药物的潜在毒性和发现临床前试验的相关动物种属，其结果可能影响研发者对非临床安全性试验的决策。但是，业界对 TCR试验在多大程度上能够指导非临床安全性和临床试验仍存在争议。例如，有研究表明抗体与非靶器官的结合不一定预示相应部位的组织损伤，TCR试验结果与临床不良反应可能未必高度相关。利妥昔单抗临床上出现恶心、呕吐、轻度脱发和肝功能受损等不良反应［9］，但非临床安全性试验并未在胃肠道或肝脏组织上发现组织交叉反应。
Bussiere 等［10］针对多国多个制药企业的生物分子药物研发过程的回顾性研究数据显示，在 56 个单抗类药物研发案例中，只依据 TCR试验结果而准确预测临床不良反应的成功率仅为 2% ，73% 的研发案例未将 TCR试验结果作为指导相关动物种属选择的唯一依据。另外，由于某些抗原位点在体内无表达活性，抗体体外与非靶组织抗原位点的结合在体内可能不会实现，若仅依据 TCR试验结果推测毒性，可能造成对靶器官毒性的过度评价。
随着生物制药工程技术的发展，单克隆抗体已从原先的鼠源化逐步发展为人源化或纯人单抗，为 IHC 试验技术带来了新的挑战。首先，由于特异性的抗-鼠二级抗体较易识别鼠源一级抗体，不易受人和非人灵长类内源性或鼠 IgG 的干扰，IHC 技术检测鼠源单抗与靶抗原的结合相对容易。而随着单抗亲和力的提高和免疫原性的降低，一方面扩大了交叉反应组织的范围，导致非特异染色增多; 另一方面，人组织中高浓度的内源性自身抗体会干扰抗-人二级抗体识别相对低浓度的人源化或人抗体。对由基因工程技术改造天然结构得到的抗体样生物制品如 Fc-融合蛋白来说，商业购买到的抗-人二级抗体无法识别，这样的全新结构 造成单抗的标记技术难度增大［11］。
最后，国际上交叉反应试验用人体组织主要来自“组织银行”，该体系通常由学术性医学研究机构或CRO公司运作，而我国标准化TCR人体组织库尚在发展和完善的过程中，现阶段国内获取人体组织仍存在困难。
总体来看，目前组织交叉反应研究中存在诸多因素，例如试验用组织的质量和抗原保存情况、试验操作技术和病理学家的经验及专业判断等都会影响对试验结果的解释和准确判定。因此，推动和建立TCR试验用组织、试验体系、试验操作、结果判定以及试验总结报告的标准化，是确保研究数据客观、准确的有效手段。
3 TCR试验在单抗类药物非临床研究中的应用和审评考虑
在单抗类药物非临床研究阶段，TCR试验首先被用于相关动物种属的筛选，选择与人靶抗原表达强度和部位最相似的动物作为相关动物，再用选定的相关动物进行目标病变部位和正常组织的 TCR试验，预测可能的毒性，最终结合体内毒性试验暴露的毒性靶器官提示临床潜在的安全性风险。此外，尽管现有法规和指导原则尚未论证其科学性，TCR试验实际上还被用于可比性研究，评价生物类似药或生产工艺等变更前后产品生物学特性的相似性。
3. 1 TCR试验用组织材料和试验技术选择
TCR试验通常采用 IHC 技术对人和动物的冰冻组织切片进行染色。组织切片主要有新鲜组织和固定组织切片，相比于固定组织切片，新鲜组织冰冻切片上组织抗原未经过固定液处理，抗原保存最接近生理状态，是理论上首选的试验标本，也被最广泛的应用于国外的TCR 试验［2］。需要指出的是，相比于固定组织切片，新鲜冰冻切片的形态易受操作程序、保存条件和时间、切片温度等因素的影响，处理不当可能造成形态学改变，造成抗体定位靶抗原的困难。而且，有研究指出新鲜冰冻切片并非适用于所有靶抗原［12］。
目前我国人体新鲜组织获取仍有一定的困难。由于国外人体尸检率高，组织获取相对容易，而国内的标准化 TCR人体组织库尚未建立，仅有少数药企向国外购买新鲜组织，组织来源多为高加索人种，人种遗传背景与我国不同。大部分国内企业获得的人体新鲜组织的来源复杂，组织的保存、组织是否来源正常成人、组织结构的完整性缺乏必要的检查和验证，组织质量难以保证。因此，现阶段固定组织切片仍可用于我国 TCR试验，但更提倡以新鲜冰冻组织作为首选。
组织芯片技术目前也广泛运用于TCR试验，但组织芯片取样面积小，常不能涵盖器官完整的组织细胞结构，存在漏检等技术问题，一般建议用于研发早期 TCR试验前的高通量筛查［3］。在技术要求方面，建议芯片制作方提供组织来源的完整信息，如供体的一般情况( 包括性别、年龄、种族) 、临床病史、死亡原因、取样时间、处理办法、储存条件、保存时间等。
3. 2 TCR试验的非临床安全性研究案例
作者将结合研发案例探讨TCR试验的相关技术要求和评价考虑。
案例 1: 受试物为人白介素 6 受体 ( IL-6Ｒ) 单抗，与人和食蟹猴有相似的组织交叉反应，故选择食蟹猴作为相关动物种属。受试物与人肝细胞、子宫上皮细胞、神经胶质细胞的组织交叉反应未在食蟹猴组织中出现，食蟹猴体内毒性试验未提示肝脏毒性。但是，临床试验中观察到可逆的肝酶指标异常、总胆固醇升高等肝毒性反应。在该案例中动物组织交叉反应结果和毒性试验暴露的毒性靶器官与临床试验毒性靶器官不完全一致。分析认为人与动物在基因、药物组织分布等方面的差异会影响TCR试验对药物临床潜在毒性的预测，人组织交叉反应结果也仅能部分预测临床毒性反应，提示 TCR 试验的意义更多在于筛查。
案例 2: 受试物为可与在多种实体瘤中高表达抗原特异性结合的抗体药物偶联物 ( antibody drug conjugates，ADC) ，由于偶联的小分子药物可能具有潜在的心脏毒性，申请人首先用犬进行了体内心血管毒性研究，结果显示受试物和裸抗体给药后犬均出现了胃肠道毒性反应，对剖检取得的组织进行 IHC 检查发现受试物可与胃肠道上皮细胞特异性结合。申请人进一步对大鼠、犬、食蟹猴和人组织进行了TCR试验，发现受试物在人肠组织中表现出与抗原高表达犬相似的组织交叉反应性，而与食蟹猴、大鼠的相似性较差。临床 I 期试验随后观察到上消化道毒性反应，可能与受试物和消化道的非靶抗原结合有关。该案例依据TCR试验结果选择了合适的相关动物种属并成功预测了毒性靶器官以及临床试验的不良反应。
案例 3: 受试物为抗肿瘤 ADC 药物，申请人采用 IHC 方法检测了受试物和裸单抗与正常人体组织、食蟹猴组织、大鼠组织以及人肿瘤组织的交叉反应性，结果受试物和裸抗体均能与人和食蟹猴组织发生特异性结合，与大鼠组织无特异性结合，提示猴为相关动物种属; 与人肿瘤组织存在反应性，提示与药效靶部位的结合活性; 受试物与裸抗体的组织交叉反应组织基本一致，提示裸抗体由于失去共价结合而结合到非靶组织从而导致非预期毒性的风险较小。由于结合型抗体可能被降解而产生脱靶的安全性风险，申请人又针对受试物和免疫结合物中各组分( 如游离的细胞毒性小分子药物、裸抗体) 进行了猴体内毒性试验，结果发现受试物暴露的毒性靶组织与猴组织交叉反应提示的组织不一致，而与游离小分子药物的毒性反应基本一致，提示受试单抗的安全性风险可能主要来自降解的小分子药物。本案例中，TCR试验并未准确预测受试药物的毒性，但提示了受试物潜在毒性可能主要来源于脱靶小分子偶联物，提高了研发者对于小分子药物安全性风险的关注。该案例提示我们应根据毒性试验的整体结果来判断 TCR试验的相关性。
案例 4: 受试物亦为抗肿瘤 ADC 药物，靶抗原被认为存在于肿瘤组织和子宫。裸抗体与正常人组织有反应性，但与大鼠、食蟹猴无组织交叉反应，为确定相关动物种属，申请人又进行了犬、豚鼠、兔、仓鼠、食蟹猴、狨猴等的组织交叉反应试验，结果显示狨猴是唯一与人有相似反应的种属，于是进行了狨猴体内毒性试验并观察到严重的眼毒性，但人和狨猴组织交叉反应试验并未观察到受试物与眼的特异性结合。申请人于是追加了体外试验证实了靶抗原在眼的分布，更换免疫组化试验使用的抗体重新进行TCR试验，结果观察到了受试物和眼组织的结合，最终受试物由于严重的眼毒性未进入临床试验。该试验中组织交叉反应阳性组织与体内毒性试验暴露的毒性靶器官不一致，更换抗体后才显示出一致性，说明技术问题会影响TCR试验对毒性靶器官的准确预测。
案例 5: 受试物为抗 CD20 单克隆抗体，按利妥昔单抗生物类似药思路研发。申请人检测了受试物与人体组织、2 种 B 淋巴细胞瘤细胞株的组织交叉反应，结果受试物与人组织免疫反应阳性区域主要集中在 B 淋巴细胞聚集区，如脾小体、脾索以及淋巴结内生发区，体外 B 淋巴细胞瘤细胞株呈强阳性染色，提示受试物可与药效靶部位特异性结合。另外，作为生物类似药，建议进行比对的组织交叉反应试验，为两者体外生物活性相似性提供证据，为非临床一致性的判断增加证据权重，研发和审评将依据其一致性结果来决定后续临床试验的简化程度。
3. 3 评价思路和审评考虑
以上案例中TCR 试验结果的相关性各不相同，有时 TCＲ 结果与相关动物体内毒性和临床不良反应具有相关性，成功的预测了临床安全性风险，系最理想的情况。但实践中由于受到人与动物种属差异、试验技术制约等因素的影响，TCR试验结果可能与相关动物种属体内毒性和临床不良反应不相关。当结果无相关性时，应参考对相关抗原在动物和人体内表达分布特性等情况的认识，通过对毒性试验结果的整体评价，谨慎分析潜在的安全性风险，TCR试验仍可能具有积极的指导意义。例如案例 3，虽然TCR结果与受试 ADC 药物体内毒性反应不相关，但通过对试验结果的整体分析，仍然提示了 ADC 药物中小分子偶联药物脱靶相关的安全性风险。在案例 4 中，由于测定技术的局限造成了TCR试验的不相关结果，当重新建立试验方法后，TCR试验最终成功提示了受试药物的非靶器官毒性，顺利指导了研发进程，提示我们发展、改进以及使用新试验方法对TCR具有重要意义。总的来说，在运用TCR试验结果指导单抗研发时应遵循个案化原则，应结合整体药理学和安全性试验结果来评估TCR试验结果的相关性［2］。
正如前文所述，TCR试验甚至体内毒性试验并不能完全预测药物临床试验的毒性，可这并不妨碍TCR试验在当今单抗类药物非临床研发过程中发挥重要作用，因为尽管人用单克隆抗体一般具有较好的安全性和耐受性，但仍存在抗体与非靶组织抗原结合而导致的安全性风险，尤其当不能获得相关抗原动物模型时，组织交叉反应性检测可以预测临床试验潜在的安全性风险和提示临床试验中采用更保守剂量方案的必要性，具有重要的风险提示作用。
参考文献
［1］王军志.生物技术药物研究开发和质量控制［M］. 北京: 北京科学出版社， 2007: 363．
［2］LEACH MW，HALPEＲN WG，JOHNSON CW，et al． Use of tissue cross-reactivity studies in the development of antibody-based biopharmaceuticals: history， experience， methodology，and future directions［J］． Toxicol Pathol，2010，38( 7) : 1138 －1166．
［3］林志，屈哲，吕建军，等． 单克隆抗体类药物组织交叉反应常见问题的探讨［J］.中国新药杂志，2012，21 ( 14 ) : 1600 －1606．
［4］CFDA．人用单克隆抗体质量控制技术指导原则［EB /OL］． ( 2003-03-20) ［2015 -11-21］. http: / /www.Cde. Org.cn /zdyz.do? method = largePage＆id = 39．
［5］林志．免疫交叉反应在单克隆抗体类药物临床前安全性评价中的应用［J］. 毒理学杂志，2007，21( 4) : 303．
［6］FDA．Points to consider in the manufacture and testing of mono-clonal antibody products for human use[EB/OL].(1997-02-28)[2015-11-21].http://www.fda.gov/downloads/biolog-icsblood vaccines/guidancecomplianceregulatory
information/othe-rrecommendationsformanufacturers /ucm153182． pdf．
［7］ICH．Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived phar-maceuticals S6( R1) [EB/OL].(1997-07-16)[2015-11-21]. http: / /www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S6_R1/Step4/S6_R1_Guideline． pdf．［8］EMEA( CHMP) . Guideline on strategies to identify and mitigate risks for first in human clinical trials with investigational medici-nal products［EB /OL］.( 2007 -09 -01) ［2015-11-21].http: / /www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09 /WC500002988． pdf．
［9］潘萌，孔蕴，陈畅，等． 单克隆抗体药物的研究进展［J］． 中国生化药物杂志，2008，29( 1) : 62-64．
［10］ BUSSIERE JL，LEACH MW，PRICE KD，et al． Survey results on the use of the tissue cross-reactivity immunohistochemistry assay［J］． Regul Toxicol Pharmacol，2011，59( 3) : 493-502．
［11］林志，吕建军，屈哲，等． 单抗药物组织交叉反应中不同免疫组织化学方法的比较性研究［J］． 医学研究杂志，2012，4(18) : 25-28．
［12］SHI SR，LIU C，POOTRAKUL L，et al． Evaluation of the value of frozen tissue section used as“gold standard”for immunohisto-chemistry［J］． Am J Clin Pathol，2008，129( 3) : 358-366．