直接抗丙肝病毒新药中的生殖毒性研究评价
药审要点 ｜ 直接抗丙肝病毒新药中的生殖毒性研究评价
文章来源：CDE官网“电子刊物”：20170103
直接抗丙肝病毒新药中的生殖毒性研究评价
笪红远
国家食品药品监督管理总局 药品审评中心
【摘要】随着对丙肝病毒（HCV）的研究深入，慢性丙型肝炎（CHC）治疗领域逐渐成为关注焦点之一。本文通过整理和分析国外治疗CHC的直接抗病毒治疗药物（DAA）公开的药品信息，将生殖毒性试验信息进行汇总，以期丰富对DAA药物生殖毒性的了解。
【关键词】慢性丙型病毒性肝炎；生殖毒性试验；抗病毒治疗；药物研发新药上市申请所需提供的非临床安全性试验数据资料通常包括安全药理学试验、单次给药毒性试验、重复给药毒性试验、遗传毒性试验、生殖毒性试验等[1]。非口服途径给药的药物需进行特殊安全性试验，复方制剂还需进行各成份相互影响的安全性试验；因存在致癌性担忧原因或临床上拟长期应用的药物还需进行致癌性试验；根据具体情况还应进行其他特殊非临床安全性试验，以进一步评估光毒性、免疫毒性、幼年动物毒性或依赖性等。其中，生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）作为药物非临床安全性评价的一部分，与单次给药毒性、重复给药毒性、遗传毒性等研究有着密切的联系，是评估药物开展临床研究风险和上市后安全性的重要内容。药物研发过程中应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症和适用人群特点、临床用药方案等，进行合理的试验设计，开展生殖毒性试验研究，以支持临床方案设计，降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险。
一、生殖毒性试验的一般考虑
目前，我国现有药物研发技术指导原则体系基本涵盖了非临床安全性研究的各方面，为新药研究与评价提供了重要的参考依据。从上世纪的《新药审批办法》开始，对新药进行生殖毒性研究就有明确要求。现行的《药品注册管理办法》中规定，对用于育龄人群的药物，应当根据其适应症和作用特点等因素对生殖毒性风险进行评价，必要时提供生殖毒性研究资料；2006年11月国家局药品审评中心发布的《药物生殖毒性研究技术指导原则》中详细阐述了关于生殖毒性研究的总体考虑，试验内容，结果分析与评价，及阶段性要求等；2005年12月《预防用生物制品临床前安全性评价技术审评一般原则》、2006年11月《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》和2007年1月《治疗用生物制品非临床安全性技术审评一般原则》中分别阐述了相关产品生殖毒性试验的要求；2016年8月1日“关于在新药非临床研究评价中参考使用ICH M3指导原则的专家共识意见”中，明确了生殖毒性的阶段性数据要求，对申请临床试验和上市申请新药的生殖毒性的阶段性数据要求达成共识，与ICH M3中内容的基本保持一致 [2]，2016年8月5日在CDE网站发布了通知公告。生殖毒性试验是新药非临床安全性评价的重要内容，其目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。其在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用[3，4]。目前国际上已发布的生殖毒性研究与评价相关的指导原则包括但不限于：ICH S5 -药品的生殖毒性和雄性生育力毒性检测的指导原则；ICH S6 -生物技术药物的非临床安全性评价；ICH S9 -抗肿瘤药物的非临床评价；FDA -用于传染性疾病的预防性疫苗生殖毒性试验的考虑；FDA -生殖与发育毒性-研究结果综合评价相关性指导原则；FDA -睾丸毒性：药物研发期间的评估行业指导原则；FDA -妊娠妇女药代动力学研究指导原则；FDA -妊娠妇女药物暴露风险评估指导原则；FDA -以哺乳期妇女为受试人群的临床研究指导原则；EMA -生殖毒性的风险评估；WHO -疫苗非临床评价指南。这些指导原则对在我国开展生殖毒性研究有很好的指导意义和参考价值。ICH M3《支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》对支持新药临床试验和上市申请所需的非临床安全性研究进行了阶段性要求[1]，其中阐述了针对用药人群，应在适当的时候进行生殖毒性试验。由于临床开发中的分期愈来愈模糊，何时开展生殖毒性试验及开展何种生殖毒性试验需结合受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症、使用人群等因素进行综合评估[5，6，7]。例如：（1）某些特殊类型的化合物（如干扰素，其唯一相关动物种属为非人灵长类动物）的潜在生殖毒性可能已有大量的文献资料。如果一个相关新化合物的机理研究提示其很可能引起相似作用时，则可能没有必要进行系统的生殖毒性试验，提供评价其潜在生殖毒性的科学依据。（2）拟用于儿童的疫苗一般不用进行生殖毒性试验。拟用于妊娠妇女的疫苗必须进行生殖毒性试验。除非有证据显示疫苗在临床上不存在生殖毒性方面的担忧，拟用于可能妊娠妇女的疫苗应考虑进行生殖毒性试验。由于疫苗诱导的免疫应答主要可能影响胚胎或新生儿的发育，因此其生殖毒性试验研究一般仅考察疫苗对动物胚胎和幼仔发育的影响。（3）一些特殊情况下需提供相关的生殖毒性研究资料，如用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍、促精子生成药以及致突变试验阳性或有细胞毒作用等的新药）；另外一些情况下，如用于艾滋病的药物等，可适当延迟提交相关生殖毒性研究资料的时间。（4）抗肿瘤药物在提交上市申请时需要提供胚胎-胎儿毒性研究资料；一般毒性研究中以快速分裂细胞为靶标的药物或者已经鉴定为可导致发育毒性的药物不需提供胚胎-胎儿毒性研究资料；支持晚期或进展期癌症患者的治疗，通常不需要进行生殖毒性研究；细胞毒类抗肿瘤药物，由于作用机制决定了其很可能具有生殖毒性，鉴于其主要用于晚期肿瘤病人，因此可不进行生殖毒性试验。
二、上市DAA药物的生殖毒性情况
目前DAA药物研发热点主要集中在非结构蛋白3/4A（NS3/4A）酶抑制剂、NS5B多聚酶抑制剂及NS5A抑制剂等[8，9]。自2011年美国FDA批准第一个NS3/4A蛋白酶抑制剂之后的5年中，相继批准了5个单药、5个复方药等共10个新药用于丙肝治疗[10]。我国目前已多个产品批准进入临床试验，但尚未有新药上市。根据药物研究评价的一般原则，作为新药申请上市时视具体情况需要对药物的生殖毒性进行评估。干扰素（IFN）联合利巴韦林（RBV）用药曾作为国际上各大指南推荐的慢性丙型肝炎的标准疗法[11，12]。已获准上市DAA药物中仍有部分需要与干扰素和利巴韦林进行联合用药，临床使用时不仅需要关注利巴韦林和干扰素不良反应中对生殖毒性方面的影响，而且需要关注DAA药物本身引起的生殖和发育方面的影响，及联合用药情况下对生殖毒性方面的影响。值得注意的是，利巴韦林可诱导可逆性睾丸毒性，具有较强的致畸作用，引起胎仔的先天缺陷和/或死亡；而聚乙二醇干扰素α可能减弱女性的生育力。本文将FDA批准上市不同靶点DAA药物的生殖毒性试验信息进行汇总：
1、以NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点的单方DAA药物
FDA现已批准的DAA药物中，以NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点药物共有三个[10]，分别于2011年5月、2011年5月、2013年11月上市，依次为默克公司的Victrelis、VERTEX PHARMS公司的Incivek、和强生公司的Olysio。无论适用于何种HCV基因型人群，这三个药物的共同点是目前仍需与聚乙二醇干扰素和RBV联合治疗。
（1）Victrelis（活性成分：boceprevir）
Victrelis≥50mg/kg剂量在大鼠中可观察到睾丸毒性，该剂量下的暴露量低于临床拟用剂量（800mg TID）的暴露量，而在15mg/kg剂量时未观察到此反应。给药3个月恢复2个月的试验中，睾丸毒性可见恢复。而在小鼠或食蟹猴3个月给药试验中，剂量分别达900或1000mg/kg情况下，未发现睾丸毒性的出现，而这些剂量下Victrelis的AUC暴露分别约7和4倍的临床拟用剂量（800mg TID）。临床期间抑制素B和精液的有限分析未见任何明显的不良反应。因此，与减少的生育力相关的睾丸毒性的发现，可能仅限于大鼠。大鼠中睾丸毒性很可能在连续给药的首次给药后出现，与血清激素水平（LH，FSH，睾酮）的变化无关而是因附睾、前列腺和睾丸的重量过低所致。附睾中可见管腔细胞碎片和/或精子减少，而在睾丸中可见Sertoli细胞空泡化、精母细胞和精子细胞消耗和/或变性、生精小管萎缩。对生殖细胞成熟影响的可能性是否与受试物直接相关虽然不能完全排除，但是Sertoli细胞似乎是毒性的主要靶标。在雌性大鼠中，生育力和早期胚胎发育发现的可逆的不良反应剂量是在Victrelis剂量≥150mg/kg时，与血清激素水平（LH，FSH，孕酮和雌二醇）的变化无关。在75mg/kg剂量下（相当于人AUC暴露的1.4倍）未观察到这些变化，该剂量的AUC相当于人用剂量800mg暴露（每天3次）的1.3倍。Victrelis在大鼠和兔中剂量分别达600和300mg/kg情况下，分别相当于人用剂量暴露量的10倍和2倍，未观察到胚胎-胎儿发育或致畸性相关的不良反应，但在该剂量水平下可产生母体毒性。虽然代谢产物SCH 629144对发育中的胎儿的安全性尚未明确，但是由于在兔子中未检测到这种代谢物的存在，且其在大鼠中暴露非常低，所以当Victrelis与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联合给药时，不认为该代谢物会引起临床上的安全问题。但如果Victrelis日后用于治疗HCV感染患者时不与干扰素和利巴韦林联合用药的话，该代谢产物在胎仔发育中的安全性必须明确。此外，在大鼠产前和出生后发育研究中，对怀孕，分娩和哺乳期相关的影响母体动物或对生长，活力，发育或繁殖性能的影响的第一代，或第二代的存活能力等方面未观察到受试物相关的影响，大鼠高剂量下的暴露量相当于临床拟用剂量的AUC暴露的6.5倍。新生儿/幼年大鼠中观察到的睾丸毒性，与成年大鼠一致。
（2）Incivek（活性成分：telaprevir）
Telaprevir单用时对大鼠的生育参数有影响。对雄性大鼠生殖系统产生毒性的剂量仅在高剂量300mg/kg下，未观察到睾丸变性的NOAEL为100mg/kg，该剂量下的暴露量相当于人临床剂量暴露量的0.17倍。在大鼠生育力研究中，产生对精子的潜在影响（如活动精子百分比减少和非活动精子计数增加）的暴露量相当于人用剂量的0.30倍。此外，对生育力的影响还包括着床前丢失率、有死胎的孕鼠数及百分率的轻微增加。这些影响可能与雄性大鼠的睾丸毒性有关，但也不能完全排除对雌性大鼠的毒性。睾丸毒性在犬慢性毒性研究中未观察到。而且，接受telaprevir的受试者中检测的睾丸毒性相关的激素生物标志物（LH、FSH、抑制素B）水平与安慰剂组相当。所以认为睾丸毒性具有种属特异性。对小鼠或大鼠胚胎发育未见不良的药物相关性影响。由于在兔中无法获得充分的系统暴露，所以未进行药物对兔的胚胎-胎仔发育毒性研究。围产期/产后评价中药物相关的发现仅限于离乳前幼仔存活率和体重的减少或降低。此外，在犬给药9个月试验中，可见1只犬附睾有慢性活动性血管炎，此炎症在胃、心脏、卵巢、骨、骨髓等器官的组织病理学结果中均有发现。但总的来说，与这种效应相关的原发性和继发性病变通常是可逆的。药物诱导的血管炎与犬多动脉炎一致（Hayes等，1989）通常被认为具有可疑的人类相关性（Clemo等人，2003）。使用特拉匹韦的临床研究中没有报道血管炎，进一步支持这种病变的物种特异性。
（3）Olysio（活性成分：simeprevir）
在大鼠生育力研究中，Simeprevir相关的发现包括低剂量50mg/kg和高剂量500mg/kg下着床后丢失率增加；3只雄性大鼠（50mg/kg/day的2/24大鼠和500mg/kg/day的1/24大鼠）可见精子无活性，睾丸和附睾小，及导致与其交配的三分之二雌性大鼠未受孕。给药相关的睾丸和附睾的潜在毒性在大鼠和犬重复给药毒性试验中也有观察到，但由于发生率低和缺乏明确的剂量反应关系，还不清楚睾丸/附睾的不良发现是偶发的还是药物相关的。由于兔的生物利用度过低（2.5%），Simeprevir的胚胎-胎仔毒性在小鼠和大鼠中评价。在小鼠探索性胚胎-胎仔毒性试验中，1000mg/kg和2000mg/kg剂量下可产生致畸性（露脑和吐舌）。由于给药容量从10ml/kg降到5ml/kg，高剂量设定在1000mg/kg，因此探索性中出现的致畸性在正式试验中未见。申请人认为动物来源不同及试验系统不同可以解释正式试验中未见致畸毒性的原因。正式的小鼠胚胎-胎仔毒性试验中，高剂量1000mg/kg下可见药物相关毒性包括着床后丢失率增加，胎仔体重降低，骨骼变异率高。大鼠胚胎-胎仔毒性试验中未见生殖毒性。大鼠围产期试验，高剂量1000mg/kg下有两只动物分别在D10（给药4次）和D18（给药12次）死亡。与对照组（96.2%，n=22）相比，中（94%，n=23）、高（93%，n=22）剂量组动物着床率降低。离乳后母体动物体重和体重增长明显下降。F1代动物体重明显下降（高剂量下可达20%）和体重增长减慢（高剂量下可达40%）。此外，还可见中、高剂量（500、1000mg/kg）下F1代动物尾巴弯曲；子代雌性动物翻正反射延迟，性成熟晚，这可能与继发于母体毒性有关。高剂量下子代动物自主活动减少提示给药对体格发育的影响。总的来说，上述发现并未影响动物的生存，行为，交配或生殖能力。
2、以NS5B聚合酶抑制剂为靶点的单方DAA药物
以NS5B聚合酶抑制剂为靶点的单方DAA药物，目前仅有吉利德公司的Sovaldi（活性成分：sofosbuvir）于2013年12月获FDA批准上市[10]。适用于与IFN和RBV联用，或仅与RBV联用，治疗HCV患者（基因1、2、3、4型）及HCV和HIV-1合并感染者；每天口服1次，一次400mg，疗程12或24周。需要进行肝移植的肝癌患者临床用药需48周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Sofosbuvir未见对大鼠的胚胎-胎仔或对生育力有影响，在最高剂量下，主要循环代谢产物（GS-331007）在大鼠体内的暴露量相当于人临床剂量暴露的5倍。兔胚胎-胎仔毒性试验中未见对母体和胚胎-胎仔有任何明显影响，NOAEL为500mg/kg。大鼠围产期生殖毒性试验中，除药后1小时可见剂量相关的口周白色和/或红色物质外，未见明显的母体毒性及胚胎和子代发育的不良影响。
3、以NS5A抑制剂为靶点的单方DAA药物
以NS5A抑制剂为靶点的单方DAA药物，目前有施贵宝公司的Daklinza（活性成分：daclatasvir dihydrochloride）于2015年7月获FDA批准上市[10]。联合Sovaldi和RBV，或仅联合Sovaldi扩展至可治疗HCV 基因1或3型患者。Daclatasvir每天口服1次，每次60mg。本品与CYP3A强抑制剂联用，需降低剂量为每天1次口服给药，每次30mg；与CYP3A中度诱导剂联用，需提高剂量为每天1次口服给药，每次90mg。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：在任何测试剂量下，daclatasvir对雌性大鼠的生育力未见影响，在雌性大鼠体内这些剂量的暴露量相当于人临床剂量暴露的24倍。在雄性大鼠中，200mg/kg/day剂量下对生殖终点的影响包括前列腺/精囊腺重量减轻，畸形精子最小程度地增加，以及因此产生的着床前丢失率增加，该剂量下在雄性大鼠的暴露量相当于人临床剂量暴露的26倍。50mg/kg/day剂量下对雄性大鼠生育力未见明显影响，该剂量下的暴露相当于人临床剂量暴露的4.7倍。在大鼠和兔胚胎-胎仔毒性试验中，所有生殖毒性反应均是继发于母体毒性，分别相当于人临床剂量的6倍（大鼠）和22倍（兔）。大鼠发育毒性包括胎仔畸形，胚胎死亡率高，胎仔体重降低。兔发育毒性包括胚胎-胎仔死亡率增加，胎仔体重降低，胎仔肋骨畸形和变异增加，明显影响头和头盖骨的发育。因此，对大鼠和兔母体及胎仔的NOAEL分别为50mg/kg/day和40/20mg/kg/day。大鼠围产期毒性试验显示，引起母体毒性的100mg/kg剂量下可见死胎率增加和子代体重降低，对母体和发育毒性的NOAEL为50mg/kg/day。
4、复方DAA药物
FDA现已批准的DAA药物中，复方药物主要有三种组合，分别为以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂的组合；NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合；NS5A抑制剂，NS3/4A蛋白酶抑制剂的组合。其中，复方药物中的单方由已上市药物与未上市药物组成，或由多个未上市药物组成。除Viekira park（组合包装）和Viekira XR（缓释片剂）外，其他均为固定剂量复方。
（1）以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂组合的复方
以NS5B聚合酶抑制剂和NS5A抑制剂组合的两款复方，均为吉利徳公司的品种，分别为2014年10月获FDA批准上市的Harvoni[10]和2016年6月获FDA批准上市的EPCLUSA[10]。Harvoni（活性成分：ledipasvir/sofosbuvir），每天口服1次，一次90mg（ledipasvir）和400mg（sofosbuvir），初治未肝硬化或已肝硬化的患者及经治未肝硬化的丙肝患者，疗程为12周；经治已肝硬化的丙肝患者，疗程为24周。用于治疗基因1型丙肝感染患者，可单用，也可和其它口服制剂联合使用。2015年11月，扩展至可治疗HCV 基因1、4、5、6型患者。Epclusa（活性成分：velpatasvir /sofosbuvir），用于治疗HCV 全基因型（1、2、3、4、5、6型）患者，每天口服1次，一次100mg（velpatasvir）和400mg（sofosbuvir），无肝硬化或代偿性肝硬化的丙肝患者（Child-Pugh A级），疗程为12周；失代偿性肝硬化的丙肝患者（Child-Pugh B和C级），与利巴韦林联合治疗，疗程为12周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Ledipasvir对交配和生育力未见不良影响。在雌性大鼠中，100mg/kg剂量下可见黄体、着床数目及胚胎存活数目轻微减少，这与短暂的母体体重降低和食量减少有关，该剂量下暴露量相当于人临床剂量暴露的3倍。在未见影响的最高剂量下，Ledipasvir在雌雄动物中的暴露量分别相当于人临床剂量的2倍和5倍。大鼠胚胎-胎仔毒性试验中，由于100mg/kg剂量下可见母体体重增长和食量的降低，认为对母体的NOAEL为30mg/kg。未见药物相关的胚胎-胎仔存活、内脏或骨骼的异常，因此，认为对发育毒性的NOAEL为100mg/kg。兔胚胎-胎仔毒性试验中，未见明显母体毒性和对胚胎-胎仔的影响，NOAEL为180mg/kg。大鼠围产期试验未见明显母体毒性和生殖发育毒性。Velpatasvir对大鼠对生育力和胚胎-胎仔发育未见有影响，在测试的最高剂量下，velpatasvir暴露约为RHD中人类暴露的6倍。由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以胚胎-胎仔发育毒性在小鼠、大鼠和兔中均进行了评价。小鼠和大鼠中未见对母体或胚胎-胎仔发育有影响，NOEL分别为1000mg/kg和200mg/kg。兔胚胎-胎仔毒性试验中，300mg/kg剂量下可见动物死亡，尽管死亡原因不明，但还是可见瘦弱、少量/无粪便、被毛粗糙，体重降低和食量减少等表现，所以对母体毒性和胚胎-胎仔发育的NOEL分别为100mg/kg和300mg/kg。大鼠围产期试验中，剂量达200mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Sofosbuvir生殖毒性信息如2.2中所述。
（2）以NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合的复方
以NS5B聚合酶抑制剂、NS5A抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组合的两款复方，均为艾伯维公司的品种，分别为2014年12月获FDA批准上市的Viekira Pak [10]和2016年7月获FDA批准上市的Viekira XR[10]。Viekira Pak（活性成分：dasabuvir/ombitasvir/paritaprevir/ritonavir），Ombitasvir/paritaprevir/ritonavir每天早上口服1次，每次2片（12.5/75/50mg）；dasabuvir每天早晚各口服1次，一次250mg。本品单用或与RBV联用治疗HCV基因1型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，或是合并感染HIV患者，疗程为12或24周。Viekira XR（活性成分：Ombitasvir/ritonavir/dasabuvir/paritaprevir），Viekira XR药物中的活性成分与Viekira Park相同，不同的是Viekira XR为缓释片剂，每天1次，1次3片，需与食物一起服用。用于治疗HCV基因1b型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，每天伴服2次利巴韦林，疗程12周；与RBV联用治疗HCV基因1a型未肝硬化或伴有代偿性肝硬化患者，疗程12周或24周。HCV和HIV-1共感染者，用法用量参照上述用法；肝移植患者在肝功能正常伴有轻度纤维化（Metavir评分≤2）时，推荐与RBV联用24周。生殖毒性信息同Viekira Pak。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：由于Ombitasvir在大鼠体内未能获得充分暴露，所以采用小鼠进行发育毒性研究。Ombitasvir剂量达200mg/kg，对小鼠胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响， 该剂量下Ombitasvir在小鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的25倍。雄性动物生殖器官重量的药物相关性变化（前列腺和精囊腺重量增加、睾丸重量降低）不认为具有毒理学意义变化。Ombitasvir剂量达临床拟用剂量暴露的4倍时，兔未见有药物相关的母体毒性或致畸性。兔胎仔体内的药物暴露水平约为母体血浆药物水平的1-2%。小鼠围产期试验中，剂量达200mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Paritaprevir和ritonavir剂量分别达300mg/kg和30mg/kg，对大鼠的胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响，300mg/kg剂量下Paritaprevir在大鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的2-5倍。Paritaprevir和ritonavir在300/30 mg/kg剂量下，未见小鼠有母体毒性和胚胎-胎仔的致畸性。相同剂量下，大鼠未见有母体毒性，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。Dasabuvir剂量达800mg/kg，对大鼠的胚胎-胎仔发育或生育力未见明显影响，该剂量下Dasabuvir在大鼠体内的暴露量相当于临床拟用剂量下暴露的16倍。Dasabuvir剂量达400mg/kg，未见对兔有母体毒性或致畸性，该剂量下相当于临床拟用剂量下暴露的12倍。大鼠围产期试验中，剂量达800mg/kg未见对母体影响，未见对子代的行为、生殖和发育有影响。
（3）以NS5A抑制剂和NS3/4A蛋白酶抑制剂组合的复方
以NS5A抑制剂和NS3/4A蛋白酶抑制剂为靶点的复方，目前有默沙东公司的Zepatier（活性成分：elbasvir/grazoprevir）于2016年1月获FDA批准上市[10]。餐前或餐后每天口服1片。本品单用或与RBV联用治疗慢性HCV基因1型或4型初治或经治患者，或合并感染HIV-1者，疗程为12或16周。参照FDA药理毒理综述资料和说明书所示，有关生殖毒性方面的非临床安全性研究信息显示：Elbasvir对雌雄大鼠生育力的NOEL分别为1000mg/kg和300mg/kg。尽管1000mg/kg剂量下精子数目降低了15%，但是对睾丸重量、精子活动力和形态和雄性的生育力未见影响。由于Elbasvir在1000mg/kg剂量下可见体重增长轻微减慢，所以对大鼠的母体毒性和发育毒性的NOEL分别为300mg/kg和1000mg/kg。Elbasvir对兔母体毒性和发育毒性的NOEL是1000mg/kg。大鼠围产期试验中，除1000mg/kg剂量下可见母体短暂的体重增长减慢和食量减少外，未见对大鼠有母体毒性，对子代的行为、生殖和发育有影响。Grazoprevir在400mg/kg剂量下，对雌雄大鼠的生育力和胚胎-胎仔的发育未见明显影响。Grazoprevir在100mg/kg剂量下，对兔的胚胎-胎仔发育未见明显影响。大鼠围产期试验中，Grazoprevir剂量达1000mg/kg未见对大鼠有母体毒性，对子代的行为、生殖和发育有影响。
三、临床开发过程中生殖毒性阶段性要求
ICH M3《支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则》对生殖毒性研究开展的阶段性明确如下：在重复给药毒性试验中对雄性生殖器官进行了详细检查（包括全面的组织病理学检查），雄性生育力试验完成前，I、II期临床试验可入组男性受试者。雄性生育力试验应在大规模或长期的临床试验开始前完成。在妊娠妇女进入临床试验前，各项生殖毒性试验和遗传毒性试验标准组合均应完成。如果在重复给药毒性试验中对雌性生殖器官进行详细检查，无生育可能妇女在缺少动物生殖毒性试验的情况下可进入临床试验。而对于有生育可能的妇女（WOCBP）：为使胚胎或胎儿风险降至最低，通常有两种可选方式：一是在I期临床试验前完成II段生殖毒性试验，在知情同意书中说明可能的风险。二是I期临床试验前不进行试验II段生殖毒性试验，要求临床试验过程中采取避孕措施以控制风险，但通常需要在III期前完成（视临床试验规模和时间）：①进行妊娠试验（如测定HCG β亚单位）、采用高效的避孕方法，并仅在确认月经期后进入试验。②进行受试者教育。③上述妊娠试验检测和受试者教育应涵盖整个药物暴露期间，并可能超过临床试验期间。④基于现有与生殖毒性相关的信息起草知情同意书，如与结构和/或药理作用相关的药物的生殖毒性信息等，说明未进行相关试验可能带来的风险；如无相关生殖毒性信息，应与受试者交流告知药物对胚胎或胎儿存在未知风险。在未完成动物生殖毒性试验入组WOCBP时，还需结合对药物作用机制的认识、药物类型、药物在胎儿暴露的程度等进行权衡。通常情况下，获得两种动物种属中的初步试验结果，并在临床试验中采取严格避孕措施后，WOCBP可入组小规模、短时间的临床试验（小于150人、不超过3个月）。如果超过上述规模和时间，需要完成正式试验。I段生殖毒性试验：在重复给药毒性试验对雌性生殖器官进行了评价的前提下，雌性生育力试验需要在大规模或长期的临床试验（如III期试验）前完成。III段生殖毒性试验：通常上市申请时提交。与临床试验中儿科用药人群的年龄和性别相关的生殖毒性试验对于提供直接毒性或发育风险的信息（如生育力和围产期发育试验）可能也是很重要的。对于支持男性或青春期前时期女性参与的临床试验，胚胎-胎仔发育毒性试验并不重要。
四、思考和建议
生殖毒性试验常规推荐使用大鼠或兔进行评价。如果选择其它种属动物进行试验应说明动物选择的合理性，比如因种属特异性，或因受药物全身暴露程度的限制，或因生殖毒性已比较肯定需明确生殖毒性物质特性的试验研究（而不是评估其危险性）。如由于兔的生物利用度过低，所以telaprevir和simeprevir（均为NS3/4A蛋白酶抑制剂）在胚胎-胎仔发育毒性试验中均选用了大鼠和小鼠来进行评价。而EPCLUSA（NS5B聚合酶抑制剂、NS5A蛋白酶抑制剂组成的复方）的一个组份velpatasvir由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以胚胎-胎仔发育毒性在小鼠、大鼠和兔中均进行了评价。Viekira Pak（NS5B聚合酶抑制剂、NS5A蛋白酶抑制剂、NS3/4A蛋白酶抑制剂、CYP3A抑制剂组成的复方），其中的组份Ombitasvir由于在大鼠体内未能获得充分暴露，所以采用小鼠进行了生育力、胚胎-胎仔发育、围产期毒性研究；组份Paritaprevir和ritonavir采用小鼠进行胚胎-胎仔发育毒性研究。现已获得的DAA药物非临床生殖和发育毒性信息显示：NS3/4A蛋白酶抑制剂在检测的一定剂量下可见对雄性生育力的影响；大鼠特异的睾丸毒性，雌性动物生育力的降低可能与睾丸变性有关；或在产生母体毒性剂量下可见对子代的发育毒性。临床期间抑制素B和精液的有限分析未见任何明显的不良反应。NS5A抑制剂在引起母体毒性剂量下可见有胚胎毒性，发育毒性。而NS5B聚合酶抑制剂未见明显生殖毒性。某些情况下，亲代和子代所表现出的生殖毒性可能是母体毒性所继发的，如雌性大鼠可见黄体、着床数目及胚胎存活数目轻微减少，或雄性大鼠前列腺和精囊腺重量增加、睾丸重量降低等。上述药物都可通过乳汁分泌。信息提示不同靶点的DAA药物在进行临床试验时关注点存在差异性，需要应结合毒性反应特点和安全范围设计合理的风险管控措施。对于根据非临床试验中发现（在预期的临床相关暴露水平下）认为可能对人体睾丸产生毒性的药物，在其临床研发早期阶段应制订可最大程度降低或监控人体睾丸损伤风险的计划[13，14]。如果将来有生育打算的男性将要暴露于药物，应在知情同意书中说明睾丸损伤的可能风险。临床试验期间，应在这些受试者中收集药物对睾丸影响的信息。如果认为精液参数的变化与激素紊乱有关，可考虑评估睾丸损伤的其他生物标记物（如睾酮血清浓度、促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）和抑制素B）。综合已有的DAA药物生殖毒性方面的信息来看，一是DAA药物在一定剂量下可能产生生殖毒性，主要是对雄性动物的损伤；二是与靶点相关，主要在NS3/4A靶点，尤其是一代产品，但由于适应症特殊，且目前丙肝治疗在某些情况下还需与利巴韦林和/或干扰素联合用药，所以对DAA药物的生殖毒性问题不影响药物进入临床；三是相关生殖毒性可以在临床通过生物标记物监测评估对人体的风险；四是动物种属选择应考虑药物暴露量可以充分评估毒性，为临床应用提供制订保障措施的建议。由于临床分期愈来愈模糊，从FDA批准的DAA药物的生殖毒性信息来看，何时开展生殖毒性试验及开展何种生殖毒性试验需结合受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、拟用适应症、使用人群等因素进行综合评估。生殖毒性结果相关的评价最终应落实到临床研究受试者范围的限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。在我国优先审评审批政策支持下[15，16]，目前国内已有多家企业的DAA药物进入临床II期/III期阶段，鼓励申请人应针对试验设计、提交时间等与监管部门加强沟通交流。
【参考文献】
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[15]国家食品药品监督管理总局关于药品注册审评审批若干政策的公告（2015年第230号），2015年11月11日颁布.
[16]总局关于解决药品注册申请积压实行优先审评审批的意见.食药监药化管（2016）19号，2016年2月26日颁布.