药物非临床安全性评价中肾毒性指标的分析

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药物非临床安全性评价中肾毒性指标的分析

Risk assessment of indicators in non-clinical safety study withdrug-induced nephrotoxicity implications

宁娜 1，朱飞鹏 1，王和枚 2，贺学林 1，3，韩玲1

（ 1. 国家食品药品监督管理总局药品审评中心；2. 北京昭衍新药研究中心股份有限公司；3. 浙江大学附属第一医院 ）

摘要：预测新药肾毒性的过程是一个客观、严谨的分析与评价过程，数据链的完整是其必要条件。反映肾毒性的主要检查项目包括尿检、血液生化检查、大体解剖、脏器质量以及组织病理学检查等，如何准确、客观地评价异常指标是药物非临床研究及后续临床试验中需要重点考虑的问题。本文综述了非临床肾毒性指标及其评价思路，为用药风险点的确定和临床试验方案的设计提供参考。

关键词：肾毒性；肾病；生物标志物；组织病理学

肾是药物或其毒性代谢产物富集、排泄的重要器官。近年来，因疾病谱复杂化、联合用药等，药源性肾毒性已成为导致急性肾损伤的重要原因之一^[1]。据有关研究报道，全球进入非临床研究阶段的候选化合物只有7% 因肾毒性而中止^[2]，非临床研究的肾毒性评价可能被低估。非临床安全性评价中，可提示肾毒性风险的常规指标包括尿量、尿蛋白、血清肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和组织病理学观察结果等，如何对异常指标进行深入评价是新药非临床研究及后续临床试验中需要重点考虑的问题。本文对非临床肾毒性指标及其评价思路进行综述，为临床试验中风险点的设置提供参考。

1 肾毒性指标异常与药物的相关性

在非临床安全性评价中，直接或间接反映肾损伤的检查项目主要包括针对尿液和血液的临床病理学检查，以及针对肾的大体解剖和组织病理学检查。临床病理学检查中，尿检的主要指标包括尿量、尿蛋白、尿潜血、尿糖和酸碱度；血液学指标包括红细胞系数（红细胞、血红蛋白和红细胞比容）及相关网织红细胞计数等；血生化指标包括Cr、BUN、尿酸和电解质含量（如磷、钙和钾）等，可从不同的角度反映肾功能减退的程度和持续的时间。而肾的组织病理学病变一般先于临床病理学指标出现^[2]，动物实验时，通过实验室常规染色法（如苏木精-伊红染色等），可观察大部分的病理变化，如空泡变、色素沉积、细胞坏死和炎症细胞浸润等。

非临床安全性评价应综合考虑多个指标的相互印证，判断其与药物的相关性。如某案例中，给药后雄性大鼠出现尿蛋白阳性，组织病理学检查可见肾近端小管上皮内存在轻度玻璃样小滴和散在的透明管型等病理改变。由于不良反应的严重程度存在性别差异，研究者初步推断可能与雄性大鼠特有的α2u球蛋白肾病有关。α2u球蛋白是正常大鼠肝合成的一种小分子蛋白质，经肾小球滤过，约50%在近端小管重吸收，溶酶体降解。α2u球蛋白肾病具有性别和物种特异性，只发生于雄性大鼠。外源性物质如与α2u球蛋白发生可逆性结合，可降低溶酶体蛋白酶的降解能力，导致其在溶酶体内蓄积，使溶酶体数量增加、体积增大，从而在近端小管S2段形成特征性的玻璃样小滴蓄积，进而发生单个细胞坏死、近端小管和髓袢细段连接处出现颗粒管型等病理改变^[3]。人类很少或不存在这种蛋白。若能确定尿蛋白阳性和组织病理学的玻璃样小滴、透明管型是由α2u球蛋白引起的，则可认为该药物在临床使用不会引起类似肾毒性^[4]。但是，非临床安全性评价是一个客观、严谨的分析与评价过程，不能仅根据单个组织病理学观察结果疑似种属特异性病变，就得出与人不相关的结论。该案例的数据链缺少玻璃样小滴是α2u球蛋白所致的直接证据，尚不能推断尿蛋白阳性及玻璃样小滴变性因α2u球蛋白引起。为此，研究者进一步使用α2u球蛋白抗体进行免疫组化实验，结果未见抗原抗体结合的阳性染色，直接排除了玻璃样小滴为α2u球蛋白的可能性。同时，对各个实验组的肾组织病理学切片进行复阅，发现除近曲小管的玻璃样小滴外，尚可见肾小管嗜碱性病变、上皮细胞变性、胞浆嗜碱性和透明管型等严重程度呈剂量相关性。上述变化与慢性进行性肾病（chronic progressive nephropathy，CPN）的早期组织病理学变化基本一致^[5]。CPN 是实验大鼠高发的自发性肾病，发病率和严重程度受到蛋白质或热量摄入、雄性激素、肾蛋白处理能力等多种因素的影响，最早在大鼠2~3 月龄时即可出现^[6-7]。但是，案例中肾小管嗜碱性病变和部分上皮细胞变性等病变的严重程度与药物剂量相关，无法排除上述病变与给药的相关性。但根据组织病理学检查结果中多个特征性改变，本案例认可近曲小管的玻璃样小滴为大鼠自发性病变CPN 的表现，但药物促进了自发性肾病的发生与发展。至此，研究者应根据药物相关不良反应的严重程度、可逆性等进行利弊权衡，判断是否在非临床研究阶段中止研究，还是在后续临床试验中将肾毒性作为风险点进行严格控制。

完整的数据链是预测临床肾毒性的必要条件。非临床安全性评价时，应对异常病理指标进行充分分析和解读，根据相互印证的数据判断病变出现的类型、严重程度、进展情况与药物理化性质、给药剂量、动物性别等的相关性，分析病变出现的原因以及药物导致肾损伤的可能机制，提示临床使用的风险点。同时，充分考虑种属特异性病变或动物自发性病变的特殊表现，与实验动物的不良反应进行对比，有针对地进行确证后，方可排除与药物的相关性。

2  非临床肾毒性指标的进一步探索

在新药开发过程中，考察指标的局限性可能将影响毒性评价的准确性。组织病理学检查受到取样和工作量的限制，而临床病理学的常规指标中，尿蛋白、血清Cr 和BUN 等的变化对于提示肾早期病变相对滞后，血清钙磷代谢的异常等主要反映晚期慢性肾功能障碍，同时也缺乏特异性。探索早期、敏感的检查指标是改善非临床肾毒性低估的重要途径之一。作为反映肾损伤的生物标志物，应满足下列条件：① 样本获取简易，室温下稳定；② 正常情况下，在肾中表达水平较低或不表达，损伤后表达明显增加；③ 肾功能恢复前稳定表达；④ 表达水平达到临床病理学分析的检测限。目前，人用药物技术要求国际协调委员会（International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）认可7 种早期肾损伤的尿生物标志物，分别为白蛋白、β-微球蛋白、血清胱抑素C（cystatin C）、肾损伤分子1（kidney injury molecule - 1，Kim - 1）、三叶肽因子3（trefoil factor 3，Tff3）、丛生蛋白（clusterin）和肾乳头抗原1 （renal papillary antigen-1，RPA-1）^［2］，作为常规指标尿蛋白、血清Cr 和BUN 的补充，可用于非临床肾毒性的评价。白蛋白因同性电荷相斥作用而无法通过肾小球滤过膜，可用于判定肾小球滤过膜功能变化。β-微球蛋白和血清胱抑素C 的相对分子质量较小，且不与其他蛋白结合形成复合物，可自由地经肾小球过滤到原尿中，在近曲小管重吸收并代谢分解，可反映肾小球滤过功能和近端肾小管重吸收功能。Kim-1 是近曲小管上皮细胞的一种跨膜糖蛋白，在受损后再生的细胞中高表达，可较早地反映近曲小管的损伤程度。Tff3是一种小分子肽类激素，主要由上皮细胞分泌。丛生蛋白是一种细胞外糖蛋白，肾急性缺血时表达增加。RPA-1 是一种特异性分布在肾集合管的膜结合糖蛋白，与肾乳头损伤程度有较好的相关性。在安全性评价中，敏感的检查指标可及时、快速地反映肾毒性，甚至在更早期的候选化合物发现阶段，通过体外筛选实验等即可提示化合物的肾毒性。

肾组织病理学改变仍然是非临床肾毒性评价的金指标^［2］。常规组织病理学检测如不能满足对病变部位和性质的鉴别，则需要进行特殊染色处理，如过碘酸六胺银染色（periodic acid-silver methera⁃mine，PASM）、过碘酸- 希夫染色（periodic acid -Schiff stain，PAS）染色和Masson 染色等；同时，可通过特殊生物标志物检测和电镜观察等进一步明确病变特征，分析病理机制。组织病理学检测对病理诊断人员要求较高，不同诊断人员常得出不同的病理检查结果。因此，应统一病理诊断术语，并开展病理学家的资质认证，提高病理诊断质量。组织病理学诊断术语和诊断标准的国际规范即大小鼠损伤命名和诊断标准国际协调规范（International Harmonization of Nomenclature and Diagnostic Criteria for Lesion in Rats and Mice）对大小鼠的增生与非增生性病变术语与诊断标准已做了统一规定，对规范病理诊断、促进国际间或不同机构间病理学家以及药物监管部门之间交流起到了积极的推动作用，受到广泛认可。国内毒性病理学专业人员及药物监管机构应尽快熟悉或了解。在日常药物非临床研究的病理检测中，应根据实际需要开展必要的内部或外部组织病理学检查同行评议，确保病理学检查结论准确可信。

3 结语

新药研发是一个依据数据不断向前推进的风险控制过程。非临床安全性研究是其中不可或缺的重要环节，可为临床试验提示需关注的用药风险点，并为药物上市后安全、合理用药提供数据支撑。在某些方面，还可预测临床研究中监测指标不能反映出来的潜在毒性。在对新药肾毒性风险进行评估时，应结合完整的非临床安全性研究数据链，总结病变的发生率、严重程度和可逆性，分析与药物剂量的相关性；同时综合药物作用机制、动物种属特点及自发性病变研究等进行分析，评价与人的相关性，以降低临床用药风险。

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