抗肿瘤抗体偶联药物非临床药理毒理研究的考虑要点

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抗肿瘤抗体偶联药物非临床药理毒理研究的

考虑要点

Considerations on nonclinical pharmacology and toxicology studies of antibody-drug conjugates for oncology

^{闫莉萍， 王海学， 王庆利}

（国家食品药品监督管理总局药品审评中心）

摘要：抗肿瘤抗体偶联药物通过靶向释放药物，可降低细胞毒药物的毒性风险，提高治疗指数。抗体偶联药物的组成复杂，与裸单抗和细胞毒药物相比，抗体偶联药物的研发具有更大的挑战。本文基于ICH S6和ICH S9等指导原则，探讨了抗肿瘤抗体偶联药物的非临床药理、安全性以及药动学研究的关注点和考虑。

关键词：抗体偶联药物; 单克隆抗体; 细胞毒药物; 肿瘤治疗; 非临床药理毒理研究

抗体偶联药物(antibody-drug conjugates，ADCs)的研发已有50年的历史 ^[1] 。随着美国 FDA 批准Kadcyla^®和Adcetris^®上市，ADCs的研发成为肿瘤治疗药物研发中的热点之。目前有30多个ADCs正处于临床研究阶段 ^[2] 。在 ADCs 研发与评价中尽管可以借鉴单抗的经验，但鉴于ADCs具有区别于单抗的特殊之处，DCs的研发与评价存在诸多挑战。ADCs与裸单抗的不同之处在于ADCs 必须与肿瘤细胞结合并内化，进而将小分子药物运输并释放到细胞内。抗体、小分子药物、连接子以及连接的方法学均可能影响ADCs的有效性和安全性 ^[3] 。尽管目前有许多体内外的非临床研究方法，有2个上市药物的研发经验，但如何通过优化的非临床研究来预测临床有效性和安全性仍然具有挑战。通常ADCs中的负载药物可以是放射同位素、蛋白或者小分子化合物，本文着重探讨抗体偶联小分子细胞毒药物的非临床药理毒理研究策略。

1 ADCs 的特点

1.1 靶抗原

ADCs 将单克隆抗体和细胞毒药物结合到一起，充分利用了抗体的靶向选择性强和细胞毒药物活性高的优点，弥补了抗体疗效较低和细胞毒药物毒性较大等不足。ADCs 包含抗体、连接子和药物 3个部分。其中，抗体是 ADCs 的制导系统，通过靶向特定抗原，ADCs 有效地渗透到肿瘤组织，并被肿瘤细胞吞噬进入溶酶体，释放细胞毒药物 ^[2] 。DCs的靶抗原通常具有肿瘤或疾病相关且高水平表达的特征。在肿瘤治疗中，靶抗原可以在肿瘤细胞、肿瘤干细胞、肿瘤新生血管或肿瘤基质层表达。肿瘤组织与正常组织靶抗原表达的差异与 ADCs 的有效性和安全性密切相关。抗体与靶抗原靶向结合后，靶抗原迅速内化，并在细胞表面高效循环，使 ADCs 在细胞内累积，从而引发持续的细胞毒性。合适的内化是保证在靶抗原表达的细胞产生细胞毒性的关键^［4］ 。

1.2 细胞毒药物

ADCs 负载的细胞毒药物通常比常用化疗药物的药效作用高2 ～6 个数量级^[4] ，主要为微管抑制剂类细胞毒素，最常用的是美登素和阿里他汀衍生物。美登素是天然产物，阿里他汀是合成化合物^[5-6] 。Kadcyla^®和 Adcetris^®的细胞毒药物分别是美登素衍生物和阿里他汀衍生物^[7-8] 。目前，卡其霉素和倍癌霉素类似物也逐渐成为一类有效的 ADCs 负载细胞毒药物。这类物质可结合到 DNA 上，具有匹摩尔级的肿瘤细胞抑制作用。与微管抑制剂不同，此类细胞毒药物可同时作用于增生和非增生细胞，有助于抑制对标准化疗不敏感的肿瘤干细胞。2000年批准的 Mylotarg^®是人源化CD33 抗体偶联卡其霉素，但在2010年因为有限的临床有效性和胚胎毒性而撤市。尽管如此，这一类 DNA 损伤细胞毒药物仍在不断研究中 ^[9-11] 。

1.3 连接子与偶联技术

连接子是 ADCs 的重要组成部分，连接子交联小分子药物和抗体，随抗体内化，并将小分子药物释放到靶细胞溶质中。在小分子药物释放之前，连接子与抗体和小分子的交联应保持稳定 ^[12] 。连接子交联的稳定性对于 ADCs 的有效性和安全性非常重要。稳定性较差的连接子使得小分子药物在进入靶细胞之前释放，减少了靶细胞中小分子药物的富集，降低了杀伤活性，增加了全身毒性作用。因此，理想的连接子应该能使 ADCs 药物在血浆中能保持高度的稳定性，同时在肿瘤细胞中能高效代谢/释放小分子药物。

目前，大多数 ADCs 所采用的连接子分为 2 大类^[13-15] ：可切除连接子与不可切除连接子。可切除连接子依赖细胞内的微环境(如还原、酸性条件等)，在抗体偶联药物进入细胞后，连接子本身发生降解，从而获得游离的小分子药物，交联化学键包括腙键和二硫键;而不可切除连接子则需要相应的酶降解连接子或偶联物中的抗体部分来释放药物，如二肽连接子和硫醚连接子。Adcetris ^®即采用缬氨酸-瓜氨酸二肽连接子，Kadcyla ^®(T-DM1) 中 SMCC-DM1 的连接则采用硫醚连接子。与可切除连接子相比，不可切除连接子在血浆中稳定性更好，其半衰期更长，前者在血浆中的半衰期一般为 1~2 d，而后者可长达 1 周。另外，连接子与小分子药物在抗体上的偶联位置和数量密切相关。小分子药物与抗体的偶联位点可以为抗体上的赖氨酸残基或链间/内二硫键还原产生的半胱氨酸残基等，所获得的抗体偶联药物中单个抗体上偶联的小分子药物数量为0~n 个(如 8个)不等。小分子药物的偶联数量和偶联位置具有较大的异质性，该异质性对抗体偶联药物的药效作用有很大的影响，例如，裸抗体或未充分偶联小分子的抗体竞争结合靶点，将会影响足够的小分子药物内化进入靶细胞，从而影响有效性。再如，过高的 DAＲ(drug-antibody ratio)将使得抗体偶联药物的清除速度增加，从而导致药效作用的降低^[16]。

2 非临床药理毒理研究考虑

2.1 药理学

药理作用的研究通常在药物发现阶段进行，需要开展的试验项目主要有:靶点结合活性、抗体介导的内化、体内外肿瘤增殖抑制作用、抗体依赖性细胞介导细胞毒性 (ADCC) 和补体依赖性细胞毒性(CDC)。试验中应关注 ADCs 与裸单抗、非偶联细胞毒药物之间的药理作用差异。体外靶点结合研究对药物研究初期连接子/连接方式的优化，以及体内给药试验相关动物种属选择发挥重要作用。在早期的药物优化筛选中，需要关注 ADCs 的内化，靶抗原的表达水平和 ADCs 的异质性均可能对 ADCs 的内化产生影响。通常采用免疫荧光显影技术观察ADCs 在细胞中的内化以及与溶酶体的交联。在药理作用研究中，还需要考虑 ADCC 效应和 CDC 效应。效应功能的缺失从某种程度上具有优势，ADCs与效应细胞的结合可能会减少其在肿瘤部位的聚集，阻碍其细胞内化并产生正常细胞毒性 ^[11]。在细胞水平或动物模型水平进行的药效研究是最直观反映 ADCs 药效作用的研究。

靶抗原的表达水平是体外或体内药效试验需要考虑的因素。在肿瘤治疗中，即使靶抗原与肿瘤相关，如果表达水平不高可能会影响 ADCs 与靶抗原结合并内化，继而影响细胞毒药物的靶向运输和释放。靶抗原的表达水平与临床有效性显著相关。FDA 批准的 Kadcyla^®可明显提高 Her2 高表达的乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期，Her2 高表达患者人群的无进展生存期(PFS)是 10.6个月，而低表达患者人群的无进展生存期为 8.2 个月。高表达人群的总生存期为 34.1 个月，低表达人群的总生存期为 26.5个月^[17] 。通常用免疫组化法来确认靶抗原在肿瘤细胞或正常细胞的表达水平，但是免疫组化存在难以预测生理状况下的免疫反应的缺点。动物模型中的生物分布或全身成像试验可以全面直观地了解靶抗原在全身的表达，ADCs 和抗原的结合以及内化，肿瘤组织与其他组织的分布比值。

考察 ADCs 在动物体内的药效时，首先要考虑种属差异。如果 ADCs 与小鼠的抗原没有结合活性或结合活性较低，需要考虑采用转基因动物进行药效试验，或者采用动物源抗体开展体内药效研究。转基因动物可以避免采用替代抗体，对于靶抗原在宿主血管或基质表达时，转基因动物不仅可以考察药效作用，还可以在一定程度上观察毒性反应。如果靶抗原只在人肿瘤细胞表达，不需要采用转基因动物，可以在接种人肿瘤细胞的裸鼠模型中考察药效作用。在进行细胞水平或动物模型水平的药效研究时，同时进行 PK/PD 研究、分析药物靶向分布、受体占有率、药物暴露量与效应关系，有助于临床给药方案的设计和安全性研究结果的分析。

2.2 安全药理学

通常，ADCs 的安全药理学评价可以在单次或重复给药毒性试验中进行。对于大分子药物，由于不与 hERG 通道结合，不需要进行hERG 试验。对于新的细胞毒药物，如果游离细胞毒药物在血浆中暴露量较高，那么需要考虑进行 hEＲG 试验^{[18 －19]} 。

2.3 一般毒理学

2.3.1 动物种属选择    ADCs 安全性研究的相关种属选择一般遵循裸抗体相关种属选择的基本原则，即选择药理活性与人相似的动物种属 ^[18] 。对于抗体，相关种属为在该种属存在受体和表位的表达，具有与人相似的受体配体亲和力、生物效应或者药理作用 ^[18] 。通常需要将所有的数据放在一起进行权重，选择最相关的动物种属。如果只有一个药理相关种属，可在一个动物种属进行试验。但是，考虑到ADCs 的毒性风险主要来自于小分子药物，ADCs 在非相关动物种属(如啮齿类动物)的安全性研究也是需要的，至少为短期(如 1 个月)毒性试验研究。当没有相关动物种属时，可考虑在非相关动物种属进行更长周期的毒性试验。需要进一步进行充分的安全性评价时，可考虑以下几种替代策略:替代分子、转基因动物、或者疾病模型(荷瘤裸鼠)。这几种替代策略有助于毒性风险的识别，但对于风险的定量评估作用是有限的 ^[18] 。替代性 ADCs 分子，可能由于抗体细微的变化而改变 ADCs 整体的毒性表现。相比替代分子，转基因动物在安全性评价上更有优势，但仍然存在挑战和限制，需要大量研究验证靶抗原稳定表达，需要确认下游信号通路是否与人相似。转基因动物有限的历史数据、免疫原性和子代繁殖均会影响该方案的可行性。在荷瘤动物中进行药效试验时，安全性观察可以作为一个辅助方案。

如果需要对新的细胞毒药物进行毒性试验，应按照小分子化合物遵循的原则选择相关动物种属进行一项短期给药毒性试验，通常包括在啮齿和非啮齿2种动物种属中进行安全性评价。如果ADCs的相关动物种属和细胞毒药物的相关动物种属相同，那么也可以在ADCs的毒性试验中设置细胞毒药物单独给药组^[18]。

另外需要关注一种特殊情况，即由于较强的免疫原性可能导致药物暴露不足，使得在相关种属的试验不可行。在这种情况下，应结合免疫方面的影响综合评价安全性。

2.3.2 试验实施安排    治疗晚期癌症的 ADCs 的非临床药理毒理研究的类别和时间安排可遵循ICHS9 指导原则 ^[19]，即非临床研究期限应支持临床试验计划。支持初期临床试验的非临床安全性评价以及获得的临床数据可以支持继续进行Ⅱ期临床试验或者对晚期癌症患者进行一线或二线治疗。对于晚期癌症适应证，3 个月毒性试验可以支持大规模临床试验和上市申请 ^[19] 。由于 ADCs 由多种组分组成，对于各组分单独进行安全性评价的需要和程度应进行综合考虑 ^[20] 。总体上，整体 ADCs 分子的安全性评价是主要的，由于非偶联的细胞毒药物与ADCs 的药动学和组织分布通常存在较大差异，因此，需要比较二者的毒性特征，一般比较最大耐受剂量下的靶器官。如果细胞毒药物是新颖的化合物，或者缺乏研究数据，那么需要进行安全性评价，一般在 ADCs 毒性试验中设置细胞毒药物单独给药组^[21] 或者在 ADCs 中添加一定比例的细胞毒药物^[22] 。但是，如上文所述，如果细胞毒药物的相关动物种属与 ADCs 的相关动物种属不同时，应选择相关动物种属进行一项短期给药毒性试验。多数情况下，ADCs 的毒性主要来自细胞毒药物，可不必在GLP 条件下对裸抗体进行安全性研究。有些情况下，单抗的毒性反应和细胞毒药物带来的毒性反应之间可能会有一定的关联，需要研究各组分对最终毒性的贡献。因此，裸抗体的单独毒性试验虽然不是必须的^[20] ，但可能有助于整体 ADCs 毒性研究数据的分析。连接子是否要进行单独的毒性试验取决于其在循环中的暴露以及分子性质。除非研究显示连接子在体内单独释放，否则连接子的单独毒性试验的价值有限。如果终产品中未反应连接子的含量很小^[23] ，则不必进行单独毒性试验。如果连接子需要进行毒性试验，通常在啮齿动物中进行单次给药或短期给药试验，或者在 ADCs 的毒性试验中设置连接子给药组 ^[20] 。

2.4 组织交叉反应

ICH S6(Ｒ1) ^[19] 指导原则建议在临床试验启动前进行人组织交叉反应试验，获得 ADCs 药物与正常组织的结合信息。在毒性试验动物进行的组织交叉反应试验有助于对非临床毒性试验结果进行分析，并外推到人。当亲和力、生物活性等不能确定药理作用相关的种属时，可通过组织交叉反应选择相关种属。

2.5 遗传毒性

完整的 ADCs 属于大分子，不能与 DNA 结合，应关注小分子化合物或连接子潜在的遗传毒性。对于 ADCs 中各组分(小分子化合物、连接子、小分子化合物-连接子)是否需要单独进行遗传毒性试验，应考虑剪切机制、物理化学特征等因素。如果小分子化合物药理毒理特征明确，其遗传毒性有研究文献，那么不需要对小分子化合物单独进行遗传毒性试验。对于新的小分子化合物，如果用于晚期癌症的治疗，可以在上市申请时进行遗传毒性试验^[19] 。如果小分子化合物具有遗传毒性，对其他组分进行单独的遗传毒性试验的意义有限。

2.6 生殖毒性

由于小分子化合物与抗体偶联后可能会改变小分子化合物在胚胎中的暴露，从而获得与非偶联小分子化合物不一样的生殖毒性反应。因此，通常采用ADCs 进行生殖毒性试验。ADCs是否需要进行生殖毒性试验取决于受试人群、临床适应证、药物作用机制等因素^[19]。在ICH S5 (R2)(2005)，ICH S9 (2010)和 ICH S6 (R1)(2012) ^[18-19,24] 指导原则中均对生殖毒性的要求进行了指导建议。对于适应证为晚期肿瘤的药物^[19]，上市申请时需进行胚胎-胎儿毒性试验，无需进行生育力和早期胚胎毒性试验，以及围产期毒性试验。申请在晚期肿瘤患者中进行临床试验时，无需提交胚胎-胎儿毒性试验。对于生物药物，通常在一种药理相关动物种属中评价生殖毒性^[18]。如果抗体与大鼠或兔的靶抗原不结合，那么在大鼠和兔可能不能识别抗原介导的毒性反应。这种情况下，需要考虑采用另一个种属或另外的策略来考察生殖毒性，例如采用灵长类动物或者采用与毒性动物靶抗原相结合的替代分子进行试验。对于非晚期肿瘤患者用药人群，需要进行生育力和早期胚胎毒性试验，以及围产期毒性试验。如果灵长类动物是唯一相关的动物种属时，性成熟动物3个月以上毒性试验中生殖器官的毒性评估可以评价药物对生育力的潜在影响 ^[18] 。

2.7 致癌性

适应证为晚期癌症药物的上市申请不需要致癌性试验的支持，但对于辅助用药或用于治疗具有较长生存期癌症的上市申请时，需要考虑对致癌性进行评估^[19]。对于 ADCs 来讲，需要考虑是一线用药还是辅助治疗、药理作用机制、以及是否是潜在的生长/分化因子或者是否具有免疫调节活性，应综合所有的研究结果分析致癌性试验的可行性 ^[18,25]。

2.8 药动学/毒代动力学

抗体是 ADCs 药物的主要组成部分，主要药动学特征与裸抗体类似，清除率和表观分布容积较低、半衰期较长、口服生物利用度较差、免疫原性、以及非线性分布和消除。ADCs 由于在抗体结构基础上引入了效应分子，而且是不同 DAＲ 的混合物，使得ADCs 药物的药动学研究较为复杂 ^[26] 。

ADCs 的药动学试验主要考察的特征有:ADCs的稳定性、血药浓度-时间曲线、吸收、分布、代谢及排泄(ADME)过程。如果细胞毒药物是新化合物，那么需要对细胞毒药物的生物转化、血浆蛋白结合、药物代谢酶等药动学特征进行详细研究。

在 ADCs 筛选优化的过程中，需在人和动物(药理实验或毒理实验动物)的各种介质中(如血浆、组织匀浆)考察 ADCs 的稳定性，考察各个孵育时间点的游离细胞毒药物的浓度 ^[18]。

通常，由于血样采集限制，药动学研究应当单独进行，而不是放在毒性研究中进行。在毒性研究中获得的药物暴露特征(如Cmax和AUC)仅仅有助于毒性数据的解释，不能对ADCs的药动学参数和特征进行详尽的评价。一般在药动学/毒代动力学研究中主要检测游离细胞毒药物、结合细胞毒药物和完整的 ADCs 和/或总抗体(结合抗体和裸抗体)。如果裸单抗与ADCs竞争结合靶点，那么检测裸抗体有一定的意义，否则检测裸抗体没有实际意义^[27] 。通常采用ELISA方法和亲和捕获LC-MS/MS方法测定检测游离细胞毒药物、结合细胞毒药物和完整的ADCs 和/或总抗体。采用亲和捕获LC-MS和疏水层析(HIC,hydrophobic interaction chromatography) 测定体内外样品中的DAR分布^[28]。ELISA 方法和亲和捕获LC-MS/MS方法开发过程中均需要考察关键试剂(如捕获试剂和检测试剂)和检测形式(如通用型、专属性)对DAR的敏感度^[29]。游离细胞毒药物和结合细胞毒药物可以用多种方法检测，但由于游离细胞毒药物的体循环暴露可能很低，因此对试验的灵敏度是一个挑战。通常采用放射性标记的方法来追踪整体 ADCs、游离细胞毒药物在体内的ADME，根据 ADCs、小分子化合物、裸单抗的ADME的不同特征，一般对 ADCs 中的单抗部分进行放射标记，考察ADCs的组织分布特征，对ADCs中的小分子化合物进行标记进行代谢、分布、排泄、以及物质平衡试验^[21-22,28] 。

ADCs 进入生物体后可能会引起免疫原性，产生抗药抗体。对 ADCs 的免疫原性评价有助于对药物暴露数据、临床药效和毒性结果(TK 的变化，免疫相关的毒性)进行分析^[29] 。抗药抗体可能产自ADCs 中的抗体部分、连接部分或小分子药物部分，因此在抗药抗体(anti-drug antibody，ADA)分析中可能会需要多个阳性抗体作为阳性对照。由于不同种属产生抗体的免疫机制不同，在非临床研究种属中发现产生 ADA 并不能代表人体内会出现 ADA。

2.9 非临床药理毒理研究的受试物

非临床药理毒理研究中的受试物需代表临床试验用药，在各项试验报告中需对受试物的 DAＲ、非偶联细胞毒化合物含量或者未连接连接子的含量等信息有清晰的描述。为了阐述 ADCs 产品的内化和药理毒理特性，非临床研究的受试物除选择 ADCs产品外，也需考虑采用裸单抗、小分子、单抗与小分子混合物、连接体等。若 ADCs 研发中产品规模、产地、处方等发生变化，可能需采用不同批次产品开展可比性研究。

3 结语

随着 Kadcyla^®和 Adcetris^®的上市，ADCs 的研发进展迅速。目前 ADCs 的非临床药理毒理研究尚无具体的技术指导原则，研究中 ADCs 可参考ICH S6 和 ICH S9 等指导原则，同时基于药物特点来设计科学合理的非临床药理毒理研究，最大限度地将非临床动物水平的药效作用和毒性反应外推至人，预测 ADCs 在临床应用中的有效性和安全性，从而提高临床试验的成功率，降低开发风险。新药研发者可以就初步研究结果和存在问题与审评机构沟通交流，以期获得科学规范的非临床研究支持信息。

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