结合案例介绍 ICH 溶瘤病毒非临床研究一般考虑
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文章来源：中国新药杂志 2019 年第 28 卷第 16 期
结合案例介绍 ICH 溶瘤病毒非临床研究一般考虑
张 旻，宫新江，邵 雪，闫莉萍，于 冰，叶 旋，王庆利，王海学
(国家药品监督管理局药品审评中心 )
［摘要］ 作为一种新兴的肿瘤免疫治疗方法，溶瘤病毒在肿瘤免疫治疗领域表现出较好的应用前景。溶瘤病毒除了能产生选择性溶瘤作用外，还可诱导产生局部和/或系统性的抗肿瘤免疫应答。ICH 于 2009年 9 月发布了关于《溶瘤病毒》的指导文件，就溶瘤病毒开发相关的表征、非临床和临床研究等方面的内容给出了建议。我国尚无关于溶瘤病毒产品开发相关的指南，本文结合 FDA 和 EMA 批准的溶瘤病毒药物talimogene laherparepvec(T-VEC)已公开的非临床研究资料，对该文件中涉及的非临床研究相关的内容进行了简要介绍，以期对我国溶瘤病毒产品的研发和审评工作提供参考。
［关键词］ T-VEC;ICH;溶瘤病毒;非临床研究
在早期的临床研究中发现，肿瘤消退与病毒感染或活病毒疫苗接种具有相关性 ［1］ 。这类病毒通常对肿瘤细胞具有先天性倾向(innate tropism)，可以选择性地在肿瘤组织中复制并损伤肿瘤细胞而对正常组织不造成过度损伤，称作溶瘤病毒［1 －4］ 。目前，溶瘤病毒已成为一种新兴的肿瘤免疫治疗方法［2，4 －5］ ，除了能产生选择性的直接溶瘤作用外，还可通过调控肿瘤微环境的免疫抑制状态而产生局部或系统性的抗肿瘤作用［3，5］ 。目前，全球范围内已有 3 个溶瘤病毒产品获批上市 ［4，6］ ，其中基于单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)进行基因修饰的talimogene laherparepvec(Imlygic TM ，简称 T-VEC)已被 FDA 和 EMA 批准用于手术切除后复发的黑色素瘤的不可切除病灶的局部治疗(瘤内注射)［4，7 －8］ ，也是截至目前 FDA 批准的唯一的溶瘤病毒疗法［4］ ，其研究历程对于后续同类产品的开发具有较好的借鉴意义。溶瘤病毒的治疗获益需要与因使用具有复制能力的病毒而带来的相关风险进行平衡［9］ ，对此 ICH 代表的监管机构已达成共识，并于2009 年 9 月发布了关于《溶瘤病毒》的指导文件(ICH Consideration: Oncolytic Viruses)，主要涉及溶瘤病毒产品的表征研究(选择性、分子变体和外源因子检测)、非临床研究和临床研究 3 个方面的内容［1］ 。本文结合同年6 月发布的关于病毒和载体脱落研究一般原则《General Principles to Address Virusand Vector Shedding》［10］ 和 T-VEC 的非临床研究案例，对该文件中涉及的非临床研究相关内容进行简要介绍。
1 非临床研究的一般考虑
ICH 在文件中提及，应采用拟用于临床试验的溶瘤病毒构建体进行非临床研究。在开始非临床研究之前，应充分调研和评估与该溶瘤病毒产品具有相似特征(如相同病毒株)的病毒的研究结果，这些信息可能有助于指导非临床研究的试验设计 ［1］ 。
T-VEC 基于一种新的野生型 HSV-1 病毒原代分离株(JS1)进行了基因修饰［8，11］ 。野生型 HSV-1 病毒的 ICP34． 5 通过与正常细胞中干扰素蛋白激酶 Ｒ(protein kinase Ｒ，PKＲ)的相互作用而抑制正常细胞对病毒的清除机制，并介导神经毒力［9］ 。T-VEC敲除了 ICP34． 5 基因并提前表达 US11 蛋白，使病毒不能在正常细胞中复制并提高了在肿瘤细胞中的复制能力;敲除了ICP47 基因并插入 GM-CSF，有助于提高树突状细胞的抗原递呈能力，激活系统性、特异性的抗肿瘤免疫应答 ［4，8，11］ 。在非临床研究中，通过多项体外和体内试验对上述基因修饰的毒株进行了概念验证［8，11］ 。
2 对选择性的评价
目前，已知的脊椎动物病毒中约 1/3 能感染哺乳动物细胞［4］ 。理想情况下，溶瘤病毒应能选择性地感染肿瘤细胞，或通过基因修饰提高对肿瘤细胞的选择性［12］ 。在对溶瘤病毒进行早期评价时，需关注其对肿瘤细胞的选择性，尤其是在采用动物模型进行试验之前，清楚地了解与肿瘤选择性相关的分子基础是非常重要的 ［1］ 。在 ICH 关于溶瘤病毒的考虑文件中，质量表征和非临床研究部分均提到了对溶瘤病毒选择性的评价，该文件推荐通过体外试验考察溶瘤病毒对允许细胞(permissive)和非允许细胞(nonpermissive)的选择性，研究病毒对正常细胞和肿瘤细胞的细胞毒作用、裂解和/或复制过程以及插入基因的选择性表达(如果有)。当体外试验证明溶瘤病毒的选择性存在困难或局限性时，可采用人体正常组织和肿瘤来源的原代培养物考察其选择性。在某些情况下，选择性可能仅能通过体内试验得到证实［1］ 。
T-VEC 在开发初期，考察了 17syn + (野生型HSV-1 多次传代后的实验室毒株)，JS1 (野生型HSV-1 的新分离毒株)和 OncoVEX GM-CSF (即后来上市的 T-VEC，基于 JS1 敲除 ICP34． 5 和 ICP47，转入GM-CSF 编码基因)在野生型 HSV-1 允许细胞和非允许细胞中的生长特性 ［8］ 。进一步考察了 T-VEC对正常细胞、不同组织来源的肿瘤细胞［包括结直肠癌、胰腺癌、肺癌(人和小鼠)、前列腺癌(人和大鼠)等］的体外裂解作用或细胞毒效应，并通过体内试验考察了对人结直肠癌、胶质瘤和鳞癌以及小鼠网状细胞肉瘤模型的抗肿瘤作用和基因表达情况［7 －8］ 。
3 动物模型的选择和局限性
3．1 选择动物模型时的考虑因素 需要考虑动物种属对溶瘤病毒亲代病毒的允许性。理想情况下，所使用的动物种属应既对病毒感染敏感，也对溶瘤病毒在人体中诱发的感染的病理后果敏感。在选择动物模型时，应综合考虑研究目的和病毒的倾向性、感染力、复制能力、细胞发生病变的可能性和抗肿瘤效应等。非荷瘤动物和异种荷瘤动物或同源移植模型均可用于非临床实验，但可能存在因动物种属对病毒感染和复制的易感性不足或无法全面模拟免疫反应等方面的不足［1］ 。如“2”中所述，T-VEC 分别在移植人肿瘤的免疫缺陷动物和移植小鼠肿瘤的免疫健全动物中进行了体内的有效性研究，并通过接种小鼠肿瘤的免疫健康动物考察了转入小鼠 GM-CSF 基因的替代病毒对 T 淋巴细胞激活(检测 IFN-γ 释放情况)的影响［7 －8］ 。
此外，ICH 还建议选择动物物种时应考虑该溶瘤病毒的预期临床给药方案。若预期的临床给药途径不是标准途径，如肝内动脉注射，则可能需要采用大型动物种属。若常规用于非临床试验的标准动物种属不适用于溶瘤病毒产品的评价，可考虑其他动物种属(如棉鼠、叙利亚仓鼠)的适用性。在某些情况下，可以使用通过基因修饰或细胞/组织移植手段来表达人体靶受体的“人源化”啮齿动物［1］ 。
3．2 动物模型的局限性 在评估溶瘤病毒的安全性时应考虑病毒预期的疗效。由于荷瘤状态下各种生物样本中的病毒水平和持久性可能与非荷瘤动物明显不同，因此理想情况下异种移植或同源移植模型更能代表目标临床人群的肿瘤生物学和病理学状态，采用该模型观察到的疗效对临床结局具有更好的提示作用。因此，ICH 认可荷瘤模型可用于概念验证(proof of concept、POC)、药动学、药效学、病毒脱落和安全性的评价 ［1］。但同时也提出，荷瘤模型存在多个方面的不足:腺病毒因不能在鼠正常组织中复制，当使用肿瘤异种移植模型时，限制了对病毒复制效果的评价;通常使用的宿主动物免疫功能存在缺陷，对溶瘤病毒的免疫应答有限;肿瘤负荷增加可能导致寿命缩短。因此，采用荷瘤动物进行长期安全性评估存在一定的局限性 ［1］ 。
为弥补上述不足，ICH 推荐采用非荷瘤且生物学上敏感的动物种属作为补充，以用于溶瘤病毒的安全性评估。当溶瘤病毒含有转入的基因时，所选择的动物种属对该基因表达的蛋白具有药理学响应是非常重要的。如果转入的基因在该动物种属中无活性，则可以将溶瘤病毒工程化以表达种属特异性的同源类似物，并通过非临床研究以考察其活性和安全性。在这种情况下，应对动物实验所用溶瘤病毒进行考察，评估其与预期临床试验所用的溶瘤病毒的可比性程度，如转入基因的表达水平 ［1］ 。
由于 T-VEC 表达的人 GM-CSF 不能与小鼠的GM-CSF 受体结合，不能发挥相应的免疫调节作用，因此构建了表达小鼠 GM-CSF 的溶瘤病毒构建体，并分别通过荷瘤模型和非荷瘤模型对其有效性和安全性进行了评价［7 －8］ ;为评价替代病毒与 T-VEC 的可比性程度，采用小鼠网状细胞肉瘤移植模型对多批次 T-VEC 和替代病毒的体内抗肿瘤作用进行了比较［1］ 。
4 概念验证和药效学研究
可通过体外和体内模型对溶瘤病毒进行概念验证和作用机制等方面的研究，评价溶瘤病毒的生物活性和药理学作用对理解溶瘤病毒在体内诱导产生预期生物学效应的能力具有重要意义。所进行的研究应能阐明溶瘤病毒应用于目标肿瘤治疗时的生物学可行性，包括选择性复制和抗肿瘤活性，最终为该产品在目标人群中的使用提供科学依据 ［1］ 。概括来讲，预期通过概念验证和药效学研究确定药理学活性剂量范围、最佳剂量和最低有效剂量，以及可能最优的给药途径和早期临床试验的给药方案 ［1］ 。
为了对基因修饰后的 HSV-1 病毒进行概念验证，通过在免疫系统健全的同源移植模型中瘤内注射 T-VEC 替代病毒(表达小鼠 GM-CSF)，对注射侧和非注射侧(对侧)的抗肿瘤效果进行了评价，同时检测到肿瘤部位和血液中 GM-CSF 的表达，以及对T 细胞介导的免疫应答的影响，提示其抗肿瘤作用与直接溶瘤作用和激活系统性免疫应答有关 ［7 －8］ ，且该效应具有剂量依赖性 ［7］ 。
5 生物分布研究
动物的生物分布研究的重点在于考察溶瘤病毒向靶器官和非靶器官的分布情况。ICH 推荐采用核酸测序法进行检测，建议采用至少 1 种敏感方法(如 qPCＲ)来检测动物器官和组织中是否存在溶瘤
病毒的核酸序列［1］ 。由于溶瘤病毒具有复制能力，存在感染正常组织并在其中复制的可能性，了解溶瘤病毒给药后的感染能力对于开展生物分布研究是非常重要的。应对不同组织或基质中的病毒滴度和/或病毒核酸水平进行定量检测。在非靶组织中检出的病毒基因组序列或转入的基因显著表达时，建议对该组织或生物基质进行进一步的分析。对生物分布、临床病理学和组织病理学研究结果进行综合分析，有助于确定动物中观察到的不良安全性信号是否与病毒分布和/或基因表达相关［1］ 。
T-VEC 主要开展了 3 项生物分布研究，包括:① 以不同途径给予免疫系统健全的未荷瘤小鼠，于不同时间点(最长 84 d)采集正常组织(包括死亡动物注射部位附近的坐骨神经)、给药部位、血和尿液，采用 qPCＲ 方法检测病毒 DNA(最低定量限为64 拷贝·μg DNA－1 )。结果显示，T-VEC 经皮下注射后主要分布于注射部位，且注射部位可见轻度水肿和红斑;经静脉注射后主要分布于血液和注射部位，在心、肝、肺、脾和三叉神经可检出不同载量的病毒 DNA，上述组织未见明显的毒性反应。② 以2 个剂量经瘤内注射给予免疫系统健全的荷瘤小鼠 3次，于不同时间点(最长至末次给药后 d 84)采集肿瘤、正常组织、血和尿液中病毒 DNA 的水平，采用qPCＲ 方法可检测到病毒主要分布于肿瘤局部以及与病毒免疫清除相关的组织(如脾、淋巴结和肝)，在泪腺、鼻黏膜和尿液中检出较少，提示二级暴露(脱落)的可能性较小。此外，特别提及在大脑中检测到病毒 DNA 的 2 只动物未出现明显不良反应。③ 经瘤内注射给予同源荷瘤小鼠荷瘤模型，肿瘤组织中人 GM-CSF 的表达峰值出现在给药后 24 h，之后迅速降低;血清中 GM-CSF 水平比肿瘤中低约 2个数量级，提示 GM-CSF 的系统暴露量较低［8］ 。
6 对病毒脱落的考察
溶瘤病毒使用过程中的潜在担忧是病毒在人与人之间的传播。在该文件中将病毒脱落(viral shed-ding)定义为溶瘤病毒通过患者的分泌物(sereta) /排泄物(excreta)进行的散播(disse-mination)。病毒脱落不同于生物分布，更侧重于病毒向第三方或对可能的环境风险的评估，考察病毒的脱落有助于指导临床研究中长期不良反应的监测 ［1］ 。ICH 已制定关于病毒和载体脱落的考虑文件，对病毒脱落的检测方法(如 qPCＲ、感染力检测)和非临床研究试验设计时的考虑(动物种属选择、剂量和给药途径、取样时间和频率、研究期限、样本收集、结果解读等)进行了详细的阐述［10］ 。尽管关于溶瘤病毒脱落的非临床信息有助于预测病毒传播的可能性，但不能替代临床试验中对病毒脱落的考察;即使在非临床研究中未观察到脱落，在临床试验中仍应对病毒脱落风险进行评估。
根据 qPCＲ 检测结果，T-VEC 给予荷瘤(瘤内注射)或非荷瘤(皮下注射)小鼠后排泄物(尿液和粪便)和脱落相关组织(泪腺、鼻黏膜和唾液腺)未提示明显的病毒脱落风险;在另一项研究中，于瘤内注射后 d 8 收集肿瘤细针抽吸物(fine-needle aspira-tion，FNA)，并在 d 1 ～ d 4 和 d 9 ～ d 11 擦洗穿刺部位，对所有拭子和抽吸物进行菌斑分析(检测灵敏度 ＜1 ×10 2 PFU)，未检测到菌斑形成 ［7 －8］ 。尽管如此，在后续的临床试验中仍进一步对病毒脱落进行了考察［7］ 。此外，探索了更昔洛韦对控制溶瘤病毒复制的研究，以应对非预期的溶瘤病毒或任何分子变体可能的脱落［8］ 。
7 毒理学和安全性研究
对溶瘤病毒的毒理学评估应足够全面，以便对给药后可能出现的局部和系统性毒性反应进行识别、表征和量化。由于毒性反应类型及程度可能与溶瘤病毒的给药途径相关，因此给药途径和给药方案应尽可能模拟预期的临床使用情况。需要关注的内容包括急性毒性和长期毒性、迟发毒性、毒性的可逆性、插入突变以及任何具有剂量反应关系的试验发现［1］ 。
尽管在 ICH S6 指导原则中涉及的总体科学性原则中的某些方面对于溶瘤病毒来讲是适用的，毒理学试验仍需反映溶瘤病毒的生物学特性，包括病毒在正常细胞/组织中复制和感染，以及对病毒和/或表达的基因产生的非预期的免疫反应的可能性。此外，溶瘤病毒的生物分布和存续特征(persistence profile) 以及转入基因的表达特征(expression profile，如果存在)通常可为毒理试验的设计提供参考信息，如研究的持续时间和对动物计划解剖的时间间隔等。根据概念验证研究确定的动物种属、给药途径和程序、潜在的治疗剂量范围和给药方案应有助于指导毒理学研究的试验设计。ICH 推荐按照《Considerations General Principles to Address the Ｒisk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors》中描述的原则考虑生殖系传播的可能性［1，13］ 。
为考察野生型 HSV-1 病毒经基因修饰后神经毒力是否降低，通过1 项小鼠颅内注射试验进行了对比研究，确认 T-VEC 的神经毒力比野生型降低 10 000倍。为支持临床试验和产品上市，考察了 T-VEC 分别经皮下注射、静脉注射、前列腺内或瘤内注射给予小鼠、大鼠和犬的耐受性，均未观察到神经病理改变和对神经系统的影响 ［7］ 。此外，考察了 T-VEC 经静脉注射给予小鼠的胚胎-胎仔发育毒性试验并对胎仔血液中的病毒 DNA 进行了检测［8］ 。
8 药物非临床研究质量管理规(good laboratory practice，GLP)依从性
根据 ICH S6，某些采用特定的试验系统开展的研究，完全遵循区域性法律要求的 GLP 规范可能存在困难。在采用荷瘤动物进行的研究中，通常会采集与安全性评价相关的试验终点，因此可能需要对动物进行特殊的护理，生物安全要求也可能对开展某项溶瘤病毒的非临床研究时的 GLP 依从性造成影响。因此，如果试验是按照前瞻性设计的方案进行的，且所获得的数据质量和完整性足以支持拟定的临床试验，非 GLP 试验可能是可以接受的 ［1］ 。不过根据 ICH M3(Ｒ2)，用于支持注册申报的非临床研究，特别是毒理学试验要求遵循 GLP 规范。
根据 FDA 和 EMA 的审评报告，1 项非荷瘤小鼠生物分布试验、3 项非荷瘤小鼠皮下注射重复给药毒性试验、1 项大鼠肝动脉给药毒性试验、1 项犬前列腺给药毒性试验和1 项小鼠生殖毒性试验(均为非荷瘤动物)等关键性研究遵循了 GLP 规范［7 －8］ 。
9 结语
随着 T-VEC 的上市以及在更多的临床试验中取得的积极结果，溶瘤病毒作为一种新兴的肿瘤治疗手段在肿瘤免疫治疗领域表现出较好的应用前景［3，5，14］ 。近年来，很多研究者开始探索将一些新的病毒分离株用于肿瘤治疗，并不断尝试新的基因修饰以平衡抗肿瘤免疫应答和免疫原性 ［9］ ，以及探索不同的给药途径［5］ 、新的病毒递送方式 ［15］ 、与化疗药或免疫检查点抑制剂的联合用药等 ［3，5，16］ 。目前正在开发的溶瘤病毒主要分为两大类 ［4］ :① 具有在肿瘤细胞中选择性复制和产生裂解作用的固有特性的野生型或天然减毒的病毒株，如呼肠弧病毒、新城疫病毒、流行性腮腺炎病毒、西尼罗河病毒、腺病毒、牛痘病毒、仙台病毒等。② 经过人为改造或基因修饰且具有溶瘤作用的病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)等，这些修饰可能包括:对正常细胞中病毒复制至关重要的病毒编码基因进行突变;通过使用肿瘤特异性启动子控制早期基因表达;对病毒组织特异性和/或细胞侵入过程的改变;将目的基因整合进病毒基因组等 ［1］ 。由于这些新的病毒相关的研究信息有限，加之基因修饰引入的变量具有较多的不可预测性，在开展临床试验之前进行病毒的概念验证、有效性和安全性研究是非常关键的。
本文对 ICH 关于溶瘤病毒的指导文件中涉及的非临床研究的一般要求进行了简要介绍，并回顾了已上市产品 T-VEC 的临床前研究内容，以期为国内溶瘤病毒产品的早期开发提供可供借鉴的思路和有益的启发。建议开发者根据溶瘤病毒的设计原理和生物学特性，通过设计针对性的试验进行概念验证，考察其生物分布特点、增殖规律和转入基因的表达情况［17］ ，探索临床预测价值更高的药效学和毒理学研究动物模型［12，18］ 。特别值得关注的是，非临床病毒脱落研究可用于临床研究的准备和检测方法的评估，并建议将脱落病毒的监测纳入临床开发计划［1，10］ 。同时也应注意到，由于常规动物模型用于评价溶瘤病毒产品的安全性存在一定的局限性，许多值得关注的安全性问题，如首次人体试验起始剂量和递增方案、病毒的免疫原性或机体对病毒的免疫应答对溶瘤病毒疗效的影响、人体用药过程中和用药后可能的病毒脱落等仍有待于在临床研究中进行阐明［19］ ，这就要求研究者有必要谨慎地制订给药方案和给药途径，并遵循相关的生物安全预防措施和生物安全指南［1］ 。
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