IPRP 关于基因治疗产品生物分布研究的相关考虑

药审要点 ｜IPRP 关于基因治疗产品生物分布研究的相关考虑

IPRP 关于基因治疗产品生物分布研究的相关考虑

张旻，宫新江，叶旋，邵雪，王海学，王庆利^*

（国家药品监督管理局药品审评中心）

摘要：目前各监管机构对基因治疗产品的生物分布研究可能有不同的要求，为基因治疗产品的开发带来了挑战。国际药物监管计划（IPRP）的基因治疗工作组（GTWG）于2018 年6 月编写了Expectations for Biodistribution Assessments for Gene Therapy Products 意见书，该文件代表了当前不同地区的药品监管机构对支持基因治疗产品进入临床试验和上市申请时需要开展的非临床生物分布研究的认识，重点讨论了支持首次临床试验的生物分布研究、试验设计需考虑因素以及允许在首次临床试验后开展生物分布研究的情况。本文拟通过对该意见书的介绍，概述基因治疗药物生物分布研究的一般考虑，希望对我国基因治疗产品的生物分布研究相关的研发和审评工作提供参考。

关键词：国际药物监管计划；基因治疗产品；生物分布；FIH 临床试验

近年来，随着新的基因载体、基因编辑技术的进步，越来越多的基因治疗（gene therapy）逐渐由基础理论研究走向临床试验，基因治疗的对象也由单基因遗传病逐步拓展到恶性肿瘤、感染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、代谢性疾病等重大疾病领域 ^[1-2]。基因治疗产品进行生物分布研究是非临床评价的重要内容，其结果有助于指导非临床安全性评价试验的设计，为临床给药剂量的拟定、用药方案和临床监测计划提供参考 ^[3]。与小分子药物不同，基因治疗产品的生物分布研究是确定靶器官和预测安全性、有效性的前提 ^[4]。多个监管机构已出台基因治疗产品相关的指导原则 ^[5-6]，但对于基因治疗产品的生物分布研究存在不同的要求和期望^[7]。国际药物监管计划（International Pharmaceutical Regulators Programme，IPRP）的基因治疗工作组（Gene Therapy Working Group GTWG）于    2018 年 6 月编写了 Expectations for Biodistribution Assessments for Gene Therapy Products^[8-9]，该意见书对支持首次人体（First in human，FIH）临床试验的生物分布研究设计的考虑因素以及允许在临床试验期间开展生物分布研究的情况进行了阐述，未包括对基因治疗产品脱落和生殖系传播的相关内容。该文件涉及多种类型的基因治疗产品，如病毒载体和质粒，但不适用于基因修饰细胞。本文对该意见书进行简要介绍，以期为我国基因治疗产品的生物分布研究相关的研发和审评工作提供参考。

1   生物分布研究的意义

生物分布研究是基因治疗产品药代动力学（PK）研究的重要组成部分，用于阐明基因治疗产品在体内从给药部位到达靶组织和非靶组织，包括生物体液（如血液、淋巴结液、脑脊髓液等）的分布、存续和清除过程^[8]。生物分布研究涉及对组织和生物体液样品中基因治疗载体和转基因产物的检测。了解影响载体的体内分布、存续时间和清除相关的科学原理对于开发更安全和更有效的基因治疗产品至关重要。非临床试验期间获得的生物分布数据将有助于非临床安全性研究的设计，如给药方案、活性和安全性相关参数的监测、动物解剖时间的选择等 ^[3，5]，并为人体试验的剂量水平、给药方案和监测计划提供信息 ^[4，8]。对于缺乏人体用药经验的基因治疗产品，在开展 FIH 之前，应开展生物分布研究以阐明其在体内的生物分布特征。这与支持药物进行临床试验和上市的非临床安全性研究指导原则（ICH M3）中的要求稍有不同，足见体内生物分布研究对于基因治疗产品开发的重要性 ^[10]。在某些情况下，生物分布研究也可以在后期临床试验期间进行 ^[3，8]。

2  意见书的起草背景

基因治疗讨论组（GTDG）于 2000 年在 ICH 框架下成立，其目标是分享信息并探索对相关原则的协调，目前已起草基因治疗领域相关的 3 份 ICH 意见书，涵盖种系整合、载体脱落和溶瘤病毒三个方面 ^[11-12]。2009年，GTDG 因资源不足而中断。为探讨基因治疗产品领域科学和临床进展，于 2012 年成立了监管机构论坛基因治疗讨论（RFGTDG），该工作组于 2013 年正式纳入国际药物监管计划（IPRP）的基因治疗工作组（GTWG）。自 2018 年 1 月起，IPRF 重组为 IPRP。GTWG 认识到在基因治疗产品开发计划期间进行生物分布研究的重要性，并承认各监管机构可能有不同的要求和期望，从而对产品开发带来挑战 ^[13]。2015 年5月 16 ～ 17 日，GTWG 组织了来自 10 个国家和地区的监管机构在美国新奥尔良召开会议，协调基因治疗产品生物分布评估要求，了解不同地区生物分布研究数据的用途以及基因治疗产品生物分布研究的进展，并就以下问题进行了讨论：如何通过生物分布研究指导临床试验设计；生物分布研究检测方法；如何应用生物分布研究数据评价临床试验中的安全性；临床前数据共享 ^[9]。在此背景下，IPRP GTWG 于 2018 年 6 月编写了该意见书 ^[8]，以传达来自不同地区的专家对支持临床试验和上市申请时获得的非临床生物分布数据的当前认识。

3  意见书涉及的主要内容

与常规的非临床研究一样，基因治疗产品的生物分布研究建议遵循 3R 原则（减少 / 改进 / 替换），以减少不必要的研究。文件中涉及的主要内容如下 ^[8]：

3.1 支持新药临床试验申请（investigational new drug，IND）的生物分布研究

在该文件中，建议在 FIH 临床试验前完成相应的生物分布研究。如果缺乏必要的生物分布研究数据可能无法充分理解并预测可能的临床风险，也无法确定 FIH 试验的最大推荐起始剂量；此外，如果生物分布研究数据不完整或数据有限（如研究中未使用合适的动物种属或未采用合适的给药方案），则可能需要进行额外的生物分布研究或对 FIH 临床试验方案进行修订。

对大多数基因治疗产品来讲，在开始 FIH 临床试验之前需进行非临床药效学（PD）研究 [ 也称为概念验证（POC）研究 ]。为更好地理解基因治疗产品与拟定的治疗用途相关的特征，POC 研究通常包括体外试验和在相关动物种属和 / 或疾病模型中开展的体内试验，这些研究有助于阐明载体（必要时还包括转基因表达产物）是否能到达预期的靶组织 / 细胞，并产生相应的生物学活性（即基因表达和功能）。因此，考察载体及其表达的转基因产物的生物分布特征对于解释 POC 研究中观察到的任何潜在的治疗效果是非常重要的。

此外，生物分布研究结果和其他非临床安全性终点（如临床病理学和组织病理学）相结合，有助于确定载体和 / 或转基因产物在某些组织中的分布是否与基因治疗产品对该组织的损害作用或毒性具有相关性。在开始 FIH 临床试验之前，对任何值得关注的毒性发现进行深入的研究有助于理解这些发现的特征，以及可能由此带来的影响，并阐明基因治疗产品的获益和可能的风险。

综合非临床药效学、生物分布研究和安全性研究的数据，可提供全面的基于“证据权重”的分析，以确保合理地预测临床试验的疗效和安全性。

3.2    临床试验期间开展生物分布研究的情况

在启动 FIH 研究后，针对临床试验期间特定的研究需要，有必要开展额外的非临床生物分布研究。在文件中列举了可能在临床试验期间触发对基因治疗产品进行生物分布研究的几种情况：

（1）临床试验剂量、给药途径和 / 或给药方案 / 给药频率发生了明显变化：给药剂量水平和 / 或给药途径不仅影响组织中载体和转基因产物的水平，还可能影响载体和转基因产物向其他组织的传播。如果在最初的生物分布研究中已经对最大可行剂量进行了检测，即使临床试验中给药剂量发生了变化，也可能不再需要进行额外的生物分布研究。针对临床试验中出现的变化，可以通过额外的毒理学研究获得生物分布研究的信息。

（2）载体结构和 / 或血清型发生重大变化（如“3.5”项下所述），以及可能导致趋向性发生改变的遗传修饰。

（3）对表达框的基因序列的修饰：对先前已完成表征的载体表达框的改变通常不会导致载体生物分布特征的变化，因此不会触发外的生物分布研究。但这些变化可能影响转基因的表达和 / 或表达的转基因的毒性。如在转基因表达框中添加新的启动子序列可能导致转基因表达程度的增强，这反过来可能增加相关的毒性风险。

（4）在单个基因治疗产品中加入多种载体：这种情况可能导致每种载体表达元件的生物分布特征发生改变。

（5）生产工艺的变更：如载体处方和病毒滴度是否需要开展额外的生物分布研究将取决于生产工艺变更的类型和程度。

（6）适应证或目标人群的变化：如最初的生物分布研究是在单一性别动物中开展的，而第二种适应证针对两种性别的人群。

临床开发的目标是从早期临床试验推进到晚期临床试验，为确保基因治疗产品以无缝设计的方式供给患者使用，研究者预先对上述情况进行考虑并做好相应的准备是非常有必要的。

3.3    生物分布研究的试验设计

基因治疗产品非临床生物分布研究的目的是支持对活性（有效性）和安全性的评估。生物分布研究应采用生物学相关的动物种属，如应考虑允许载体转导并且对特定的目标转基因产物具有生物学响应的种属。

为获得有意义的研究数据，在设计生物分布研究的试验方案时应考虑以下因素：

（1）推荐采用最终临床处方制备的基因治疗产品。必要时，如提供了恰当的科学性数据和证据，使用其他处方也是可以接受的。

（2）如可行，建议采用预期的临床给药途径；如采用其他给药途径，应进行合理性论证。

（3）推荐采用两种性别的动物；如采用单一性别的动物，应进行合理性论证。

（4）每个解剖时间点，应确保每组每种性别具有足够的动物数。

（5）对可能影响载体分布和 / 或持久性的实验系统相关的因素进行评估，如动物年龄、生理状况和对给予的载体和 / 或转基因产物产生免疫应答的能力。

（6）至少包括 1 个媒剂对照组和 1 个给予临床相关剂量水平的基因治疗产品组，额外的剂量水平，如最大可行剂量，可能有助于提供剂量依赖性信息。

（7）样本采集时应选择预期能反映载体检出量达到峰值和消除相的时间点。该研究应持续进行，直至载体信号明显下降或达到长久的信号平台期。对于大型动物种属，由于动物使用数量过多，在多个时间点获得组织可能是不可信的。为弥补这一不足，可考虑在观察期内多次采集生物体液。

（8）将生物分布评估与其他研究（即 POC 或安全性研究）相结合。生物分布研究结合毒性实验可以考察载体分布及其持续存在是否与安全性和活性（有效性）研究结果之间具有相关性。

（9）建议采集完整的组织 / 生物体液，如血液、注射部位、性腺、脑、肝、肾脏、肺、心和脾脏；也可以考虑对其他组织或生物体液进行评估（如脑脊液、引流淋巴结、骨髓、眼睛、视神经和对侧部位等），具体的取材方式取决于载体类型、转基因表达产物、给药途径、疾病状况和其他因素等。在某些情况下，如果预期不会发生全身暴露或可证实没有给药部位的泄漏，经科学评估后仅采集有限的组织或生物体液也是合理的。

（10）采用可最大限度地减少污染可能性的组织或生物体液采集程序，并记录实际的样本采集方法方法。

（11）对于复制型载体，由于存在载体 / 病毒的体内复制，基因治疗产品可能会进入血液循环。如果在某一动物种属中，经单次给药后不支持复制型载体 / 病毒的体内复制，则应考虑对基因治疗产品进行重复给药。

3.4 生物分布研究的检测方法

应采用灵敏的定量分析方法进行检测，并提供详细的分析方法。在意见书中，推荐采用实时定量 PCR （qPCR）进行组织或生物体液中载体水平的检测，并随着基因治疗产品从基础研究推进至人体用药，应确保检测方法具有足够的灵敏度和重现性，并对检测方法进行方法学验证。

（1）qPCR 分析：qPCR 是一种高灵敏度的分析方法，可用于检测组织中有否有载体 DNA 序列。采用含有逆转录步骤的 qPCR 反应可用于评价 RNA。

对目标核酸序列的定量分析对于评估靶物质的相对量、累积或衰减动力学非常重要。在方法学开发过程中，检测方法的灵敏度和特异性是值得考虑的重要参数，应对靶序列在不同组织或器官中的回收率进行考察，并将其作为方法学验证的一部分。

此外，意见书中特别提及，应重视对引物的设计和     qPCR 试验条件的优化。尽管延长 PCR 扩增产物的大小可能会降低检测的灵敏度（即提高了检测限），但结果可能更具提示意义且更有容易获得真正的阳性结果。为提高特异性，可考虑利用密码子的简并性（codon degeneracy）引入独特性差异，密码子简并性不改变转基因表达产物，但可以将目标 DNA 序列与内源性 DNA 序列区别出来。

（2）检测转基因产物的其他分析方法：如果转基因产物被设计为可以经转导的细胞或组织中分泌，则可以考虑除 qPCR 之外的其他方法用于转基因表达产物的检测。这些方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组织化学（IHC）或蛋白质印迹（Western Blot）。但无论选择哪种方法，建议研究者提供所用方法的方法学和合理性证据。

3.5    基因修饰载体生物分布研究的考虑因素

意见书中特别提及了对于基因修饰载体进行生物分布研究时应特别关注的因素。载体中能与宿主细胞表面受体发生相互作用的结构在很大程度上决定了生物分布特征。开发新的血清型载体或倾向性发生改变的工程病毒，可以提高对特定细胞或组织的靶向性（或去靶向性）。尽管这些载体可能源自于进行过充分研究的病毒株或血清型，但通常应被视作新的载体，因此建议在FIH 临床试验给药之前对这些载体进行生物分布特征的考察，并深入评估这些改变是否会导致载体在体内分布特征的改变。因此，在对现有产品（或之前研究过的产品）进行任何修饰时，应对载体粒子大小、聚集状态、抗原性、半衰期以及与某些可能决定载体生物分布特征的其他宿主组分（如血清因子）的相互作用等进行关注。

4  结语

生物分布研究可以确定载体和 / 或表达产物在目标靶组织和生物体液（如血液、脑脊液）、非靶组织和生物体液以及生殖系（germline）中存在、持续性和清除特征，应用于指导临床前研究和临床试验设计 ^[3-5，8]。本 IPRP 意见书代表其当前对基因治疗产品生物分布研究的理解，是多个国际监管机构专家之间进行系列讨论的结果，主要涉及支持 FIH 的生物分布研究以及在临床试验期间开展生物分布研究的情况、生物分布研究的设计和检测方法、基因修饰载体的考虑因素等 ^[8]。整体上讲，这份意见书保留了 FDA 指导原则中的大部分内容，同时对相关细节进行了细化，如 qPCR 检测方法、组织类型、基因修饰载体的生物分布研究考虑因素；未包含载体脱落研究和生殖系传播相关的研究。FDA 在后来发布 的 Long Term Follow-Up After Administration of HumanGene Therapy Products（草案）（2018 年 7 月）中对非临床生物分布研究中涉及的动物试验设计、样本的采集和分析等进行了细化 ^[14]。

该文件是 IPRP GTWG 的第 1 份官方文件 [15]，不会取代任何区域性指南和法规，鼓励在注册申报时与相应的监管机构进行讨论 ^[8，13]。目前，国内基因治疗产品越来越多，但相关的研发和审评经验相对缺乏，希望通过该意见书介绍基因治疗产品生物分布研究时的一般技术考虑，为我国基因治疗产品的生物分布研究相关的研发和审评工作提供参考。

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